胃蛋白酶结合柱后在线还原法分析重组人粒细胞刺激因子的二硫键

刘海龙 任伟成 宗利 王英武

摘 要 建立了一种利用胃蛋白酶在酸性条件下酶切，结合柱后在线还原法和液相色谱-质谱联用系统分析蛋白质二硫键的方法。在酸性体系中，采用胃蛋白酶水解蛋白质，能够最大限度地维持蛋白质二硫键的原有构象; 柱后在线还原法的应用能够弥补胃蛋白酶酶切位点专一性差、数据解析困难等不足。本研究将二者相结合并成功用于分析重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）的二硫键和未配对半胱氨酸。实验结果表明，采用本方法测得经N-乙酰马来酰亚胺烷基化处理的rhG-CSF中二硫键配对方式为Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，Cys17全部被烷基化试剂结合，且未检测到二硫键错配，实现了二硫键的完全定位。不经过烷基化处理，采用本方法测得rhG-CSF中Cys36-Cys42、Cys64-Cys74和Cys17的错配比例分别为9.1%、0%和12.6%; 基于胰凝乳蛋白酶的常规方法检测到的二硫键错配比例依次为73.4%、58.1%和97.5%; 采用Glu-C和胰蛋白酶联合酶解的常规方法检测到的错配比例依次为40.3%、5.2%和22.3%。与常规方法相比，本方法检测到的二硫键错配比例更低，测定结果能够更准确地反映二硫键在蛋白分子内的实际存在状态。

关键词 胃蛋白酶; 二硫键; 柱后在线还原法; 液相色谱-质谱联用系统; 重组人粒细胞刺激因子

1 引 言

二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰类型，在稳定蛋白质的空间结构[1，2]、维持构象及发挥生物活性等方面有着非常重要的作用[3～7]。在蛋白质药物中，二硫键构型也是一个非常关键的质量属性[8]。二硫键构型分析，有利于深入地了解蛋白质的内部结构[9，10]，对蛋白质药物的研发和质量控制具有重要意义。目前，准确分析蛋白质的二硫键组成仍是一个较大的挑战[11～13]，这是由于蛋白质的结构较为复杂，随着蛋白质分子内含有半胱氨酸数目的增多，其可能存在的二硫键配对方式呈指数级增长，解析难度也相应增加。此外，二硫键错配现象的存在也会影响二硫键分析[14]。二硫键错配可能导致蛋白质错误折叠、聚合和失活[15～17]，二硫键错配可能源自蛋白质本身，也可能源自样品处理或数据采集等过程。因此，为了得到准确的二硫键构型及控制蛋白药物的二硫键错配比例，尽可能降低样品处理和检测过程中的二硫键错配是至关重要的。

近年来，在二硫键定位研究中常采用如下策略： 首先选择合适的蛋白水解酶水解蛋白质，再取出一部分酶解液做还原处理，最后将还原前和还原后的酶解液分别采用液相色谱-质谱联用系统（LC-MS/MS）进行检测，通过对比还原前后的肽图找到差异肽段，确定蛋白质二硫键的连接方式[18～20]。研究表明，酶的选择和酶解体系都会影响二硫键错配，当其它条件一定时，酶解液pH值越低，二硫键错配程度越低[21]; 常见的蛋白水解酶（如胰蛋白酶、Lys-C酶和胰凝乳蛋白酶）的最适pH值一般为7～9，弱碱性环境将促进二硫键的重排[22]，当pH≤6时，酶活性下降，不能对蛋白进行充分酶解; 嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）能够在弱酸性条件下水解蛋白质，但较容易引起二硫键错配; Glu-C酶的水解位点一般仅限于天冬氨酸和谷氨酸残基，在水解分子量较大的蛋白质时，具有一定的局限性。蛋白质分子内如存在未配对半胱氨酸，也可引起二硫键错配[23]。对于此类蛋白质，通常需要先对半胱氨酸进行烷基化处理之后再进行酶解，如果未配对半胱氨酸被包裹于分子内部，烷基化过程将难以顺利进行。因此，开发一种能够减少二硫键错配的分析方法，对蛋白质的二硫键研究具有重要意义。

胃蛋白酶是存在于哺乳动物胃液中的一种消化性蛋白酶，在pH 1～5范围内能发挥较高的活力。胃蛋白酶常见的酶解位点一般为F、L、W、Y、A、E、Q、S 和 T[24]，由于胃蛋白酶的作用位点较多，且对不同作用位点的酶切效率不同，导致酶解片段复杂程度较高，谱图难以解析，从而限制了其在蛋白质二硫键分析领域的应用[25]。柱后在线还原法是將还原剂以流动注射的方式与色谱流出端混合，并注入质谱仪进行检测的一种方法[26～28]。借助于该方法，含有二硫键的肽段从色谱柱流出后、进入离子源之前被迅速还原，其还原产物的信号可直接被质谱仪捕获，省去了对含二硫键肽段（简称二硫肽）的逐个收集、浓缩和还原等繁琐步骤。在原理上，柱后在线还原法的应用可弥补胃蛋白酶的不足，在兼顾低丰度信号的同时，使肽质量图谱的解析难度和实验成本都大大降低。

分 析 化 学第47卷

第4期刘海龙等： 胃蛋白酶结合柱后在线还原法分析重组人粒细胞刺激因子的二硫键

重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）是一种由174个氨基酸组成的蛋白质（其氨基酸序列见图1），它包含两对分子内二硫键和一个未配对半胱氨酸[29，30]。rhG-CSF分子内未配对半胱氨酸与分子稳定性密切相关[23]，也正是它的存在使得rhG-CSF产生二硫键错配的风险大大增高。已有研究表明，在rhG-CSF中存在较高比例的二硫键错配[14]，这可能对rhG-CSF药物的安全性和有效性造成较大影响。因此，准确分析rhG-CSF的二硫键配对情况在药品研发和质量控制中显得尤为重要。本研究以rhG-CSF为研究对象，利用胃蛋白酶酶切结合柱后在线还原法和LC-MS/MS对其进行二硫键和未配对半胱氨酸的定位分析，并分别在经过NEM烷基化处理和不做烷基化处理的情况下，与基于胰凝乳蛋白酶、Glu-C酶+胰蛋白酶的常规分析方法进行对比，考察二硫键错配情况，并探究在样品处理过程中二硫键错配的成因及避免（或降低）的方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Exion30AD型超高效液相色谱仪和Triple TOF 6600型高分辨质谱仪（美国AB SCIEX 公司）; 1 mL流动进样针（瑞士Hamilton公司）。

rhG-CSF原液（纯度>97%，浓度为11 mg/mL）来源于大肠杆菌发酵，采用KTAavant系统（美国GE公司）纯化。NaOH（纯度96%）、柠檬酸（纯度99.5%）和HCl（36%～38%，w/V）购自北京化工厂; 二硫苏糖醇（DTT，美国Promega公司）; N-乙基马来酰亚胺（NEM）、乙腈（质谱级）和盐酸胍（6 mol/L溶液）购自美国ThermoFisher公司; 胃蛋白酶（Pepsin）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，纯度>99%）、三（2-羧乙基）膦（TCEP，纯度≥98%）和氨水（质量分数28%）购自Sigma-Aldrich公司; 胰蛋白酶（Trypsin）、Glu-C蛋白内切酶和胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）均为测序级，购自瑞士罗氏公司; 三氟乙酸（质谱级）购自日本和光纯药工业株式会社; 超滤离心管（MWCO 3 kDa）购自德国赛多利斯公司。实验用水为超纯水，采用Milli-Q纯水系统（德国默克公司）制备。

2.2 实验方法

2.2.1 rhG-CSF的烷基化 使用超滤离心管（MWCO 3 kDa）将rhG-CSF溶液置换为含3 mol/L盐酸胍的50 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH=5.0），将rhG-CSF终浓度控制为1 mg/mL。按体积比50∶1（蛋白∶NEM溶液）加入0.1 mol/L NEM溶液，25℃孵育4 h。

2.2.2 rhG-CSF的胃蛋白酶酶解 将经过NEM烷基化处理和未经烷基化处理的rhG-CSF样品使用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（以NaOH调至pH=3.0）进行缓冲液置换，并将蛋白终浓度控制为1 mg/mL。按照质量比40：1（蛋白：酶）加入胃蛋白酶，混匀后置于37℃水浴中孵育16 h，取出后置于4℃终止反应。将酶解液取出一部分进行还原处理，以1 mol/L TCEP为还原剂，按照体积比100∶1（酶解液∶还原剂）将还原剂加入酶解液中，混匀后，室温孵育30 min。

2.2.3 rhG-CSF的常规酶解 将经过NEM烷基化处理和未经烷基化处理的rhG-CSF样品使用0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）进行缓冲液置换，并将蛋白终浓度控制为1 mg/mL，等量分装。分别向两支烷基化处理的rhG-CSF中加入胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶，蛋白质和酶的质量比为40∶1。将上述混合液置于37℃水浴中孵育16 h，取出后置于4℃终止反应; Glu-C酶酶解样品按质量比40∶1（蛋白∶酶）补加胰蛋白酶，37℃继续孵育16 h后取出，置于4℃终止反应。未经烷基化的rhG-CSF酶解样品按照上述步骤同步处理。各酶解样品均取出一部分进行还原处理： 使用1 mol/L DTT作为还原剂，按体积比100∶1（酶解液∶还原剂）加入酶解液中，混匀后室温孵育30 min。

2.3 液相色谱与质谱测定参数

2.3.1 LC-MS/MS检测

将还原处理的酶解液和未经还原处理的酶解液均采用LC-MS/MS进行检测。选用Waters peptide BEH C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）进行色谱分离，柱温为50℃，进样体积30 μL，流动相A为0.05% TFA-超纯水，流动相B为0.05% TFA-乙腈，流速0.2 mL/min。梯度洗脱程序： 0～80 min，0～37% B; 80～90 min，37%～46.5% B; 90～95 min，90% B。质谱仪在正离子模式下运行，一级质谱和二级质谱采集范围分别为m/z 300～2000和m/z 50～2200。 GS1和GS2均设定为50，CUR为35，离子源温度550℃，喷雾电压5500 V。

2.3.2 柱后在线还原法结合LC-MS/MS检测 rhG-CSF的酶解产物须另采用柱后在线还原法结合LC-MS/MS进行检测。在线还原剂为含有0.2 mol/L DTT的9%氨水溶液，流速5 μL/min。柱后在线还原装置的构建方法如下： 将流动注射针、液相色谱紫外检测器的流出端和离子源以三通相连（图2），离子源和三通之间的流路体积控制在25～50 μL之间，目的是在减少色谱峰的扩散作用同时保证还原反应的顺利进行。其它色谱和质谱条件同2.3.1节。

2.4 LC-MS/MS数据分析

rhG-CSF的胃蛋白酶酶解样品经LC-MS/MS 采集所得原始数据文件（. wiff 和. wiff. scan文件）后，采用PEAKS软件（版本号8.5，美国ThermoFisher公司）进行肽段分析，根据图1在軟件中输入rhG-CSF的氨基酸序列，选择搜库模式并设置参数为胃蛋白酶酶切、分子量误差20 ppm、Spider检索。rhG-CSF的胰凝乳蛋白酶酶切和 Glu-C+胰蛋白酶酶切所得原始数据分别采用BioPharmaView软件（版本号2.0，美国AB Sciex公司）进行数据分析，输入rhG-CSF的氨基酸序列和所有可能形成的二硫键配对方式（包括自身错配），选择Peptide Mapping模式，并在“Digest Agent”选项中选择对应的酶，最多漏切位点数目设为4个。

3 结果与讨论

3.1  rhG-CSF的二硫键定位和未配对半胱氨酸分析

由于胃蛋白酶的酶切位点较多，且表现在各个酶切位点的活力各不相同，导致经常有不完全酶解的情况出现，使酶切肽图过于复杂而难以解析。应用柱后在线还原法，可在一次进样中采集到所有二硫肽还原产物的信号，将其与不采用柱后在线还原法所获得的质谱数据进行对比，在每个二硫肽所对应的保留时间处找到其还原产物，采用数据分析软件对还原产物的一级、二级质谱进行解析，推测出蛋白质二硫键连接方式。

经NEM烷基化处理的rhG-CSF胃蛋白酶酶解肽图中，有8个色谱峰在还原后发生变化，色谱峰的保留时间分别为30.8、35.3、40.1、67.9、70.7、72.1、73.8 和75.8 min，依次命名Peak 1～Peak 8（图3）。

未还原的rhG-CSF的胃蛋白酶酶解肽图中，Peak 1～Peak 8对应肽段的分子量分别为1806.87、1788.85、1771.82、2831.45、2380.22、2616.36、2944.54和2550.32 Da。经柱后在线还原处理的质谱数据显示： 保留时间为30.8 min的色谱峰1还原后产生分子量为690.36和1118.57 Da 的两个肽段，分别对应氨基酸序号为32～37和38～46，其二级质谱信号与理论值匹配良好（图4A和图4B）。保留时间为35.3 min的色谱峰2还原后仅产生一个分子量为1790.86 Da的肽段，比原肽段增加2 Da。鉴定结果显示此肽段的氨基酸序号为32～46，其二级质谱信号与理论值匹配良好（图4C），该肽段包含2个半胱氨酸，它们互相结合形成二硫键。保留时间为40.1 min 的色谱峰3还原后产生一个分子量为1773.83 Da的肽段，分子量比35.3 min的色谱峰小17 Da，经鉴定该肽段氨基酸序号为32～46，第32位谷氨酰胺发生了焦谷氨酸化，其二级质谱信号与理论值匹配度较高（图4D）。上述3个色谱峰所包含的二硫键均为Cys36-Cys42。

Peak 4～Peak 8經在线还原后分别产生分子量为2833.46、2382.24、2618.38、2946.56和2552.33 Da的肽段，PEAKS软件鉴定结果显示，上述肽段对应氨基酸序号分别为50～77、 56～78、 50～75、 50～78 和54～78，其二级质谱分别对应图5A～5E。肽段的氨基酸序列和b/y离子匹配情况标记在相应的质谱图中，5个肽段的二级碎片与各自理论值均匹配良好。由氨基酸序列可知，Peak 4～Peak 8所对应的5个肽段均含有Cys64和Cys74，且还原后肽段分子量均增加2 Da，因此可推断Cys64和Cys74结合形成链内二硫键。

经过烷基化处理，rhG-CSF中未配对半胱氨酸的侧链巯基与NEM结合。利用PEAKS软件分析上述样品的胃蛋白酶酶解肽图数据，找到被NEM修饰的肽段，从而确定未配对半胱氨酸的位置。结果表明，保留时间为31.7和34.6 min的两个色谱峰（分子量分别为857.46和729.40 Da）被鉴定为被NEM修饰的肽段，对应氨基酸序号分别为15～20和15～19，对应的二级质谱图分别见图6A和图6B，二级碎片离子与理论值匹配良好（肽段氨基酸序列和b/y离子匹配情况均标注在图中），这两个肽段中被NEM修饰的位点均为第17位半胱氨酸。第19位谷氨酸存在不完全酶解现象，但不影响对结果的判定。根据上述结果可以确定，在rhG-CSF中第17位半胱氨酸为未配对半胱氨酸。

综上可知，经烷基化处理的rhG-CSF二硫键配对方式为Cys36-Cys42、 Cys64-Cys74，Cys17与NEM结合，与文献[14]报道一致。此外，在rhG-CSF分子中未发现天然的二硫键错配信号。

3.2 rhG-CSF在不同酶和酶解条件下的二硫键错配研究

在rhG-CSF的二硫键鉴定中，为了考察不同前处理条件（包括是否做烷基化处理、酶和酶切条件的选择）对鉴定结果的影响，选择胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶+胰蛋白酶在pH 8.0的Tris-HCl体系下分别酶切，用LC-MS/MS对酶切产物进行检测，借助BioPharmaView软件进行数据分析。此外，利用胃蛋白酶

对于经过NEM烷基化处理的rhG-CSF，在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液体系下用胰凝乳蛋白酶和用Glu-C+胰蛋白酶组合分别水解rhG-CSF，均检测到了不同程度的二硫键错配（表1），而在胃蛋白酶酶切样品中则未检测到二硫键错配，说明当分子内不存在未配对半胱氨酸时，使用胃蛋白酶在pH 3.0缓冲液中酶解，能够极大地抑制二硫键间的交换作用。而对比Glu-C+胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切结果，未能检测到Cys17的错配， 说明烷基化反应较为彻底; Cys36-Cys42和Cys64-Cys74均检测到一定比例的错配，但均<3%，表明当溶液中不存在未配对半胱氨酸时，在pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液中二硫键交换作用也会发生，但比较微弱。

对不经过烷基化处理的rhG-CSF，分析结果显示其在3种酶切体系中均发生了一定程度的二硫键错配（表1），其中胃蛋白酶酶切所得二硫键错配比例最低，Glu-C+胰蛋白酶次之，胰凝乳蛋白酶酶切的错配比例最高。主要的二硫肽及含有未配对半胱氨酸肽段的鉴定结果（包括错配形式）见表2。

含有Cys17的肽段也能够相互结合形成二硫键，这是一种“自身错配”形式。由表1中括号部分可知，胃蛋白酶酶切所得自身错配的比例为6.5%，远低于胰凝乳蛋白酶和Glu-C+胰蛋白酶酶切所得的自身错配比例（依次为24.1%和21.0%），上述差异可能与酶切体系的pH值有关，胃蛋白酶酶切的酸性体系能够显著抑制自身错配的产生。

4 结 论

建立了一种基于胃蛋白酶和柱后在线还原法分析蛋白质二硫键的方法，并实现了rhG-CSF二硫键的定位分析。胃蛋白酶具有较多的酶切位点，且适用于酸性条件，能够有效减少水解过程中产生的二硫键错配; 采用柱后在线还原法，可省去对二硫肽的收集、浓缩和还原等步骤，能够在二硫肽所对应的保留时间处直接获得还原产物，且避免漏掉色谱保留能力较弱的还原产物; 二者结合使用，样品处理过程中产生的二硫键错配显著减少，同时样品处理和数据分析的工作量降低。通过与常规二硫键定位方法的对比发现，未配对半胱氨酸、酶解体系、含半胱氨酸酶切肽段的大小和构型等因素共同影响二硫键错配的产生，而胃蛋白酶对rhG-CSF的酶切更倾向于产生含二硫键的环形肽段，降低被溶液中自由巯基攻击的风险，从而更准确地反映二硫键在蛋白分子内的真实存在状态。胃蛋白酶作为一种消化道蛋白酶，理论上适用范围较广，但仍需尝试更多不同类型的蛋白质加以验证。使用胃蛋白酶酶切结合柱后在线还原法分析蛋白质的二硫键，可为研究者提供新的方法和思路。

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