吉马酮对人非小细胞肺癌NCI-H1770细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用①

李 冰 周 平 靳 义

(哈励逊国际和平医院胸外科,衡水053000)

肺癌是世界上最常见的癌症之一，也是导致癌症死亡的主要原因。2012年全世界新增肺癌病例180万，肺癌死亡病例160万[1]。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是一种异质性肿瘤，大约占所有肺癌的85%[2]。目前对早期肺癌患者一般采用外科手术，而对患有手术切除的医学禁忌证或者不愿意进行手术的患者则采用高剂量立体定向辐射。而对于晚期肺癌患者则无法进行手术切除，一般采用胸部放射治疗的同时使用顺铂或卡铂进行双重化疗。由于阶段和地区的不同，肺癌的生存率从4%到17%不等[3]。有数据显示中药辅助治疗可提高肺癌患者的整体生存率[4]。越来越多的研究表明中草药在癌症治疗中发挥着积极作用[5-7]。中草药姜黄常用于治疗消化不良，肠胃气胀，发烧和咳嗽等疾病[8]。吉马酮是姜黄的主要生物活性成分之一，具有抗病毒，抗氧化及抗炎等功效[9-11]。另外，吉马酮还有利于乳腺癌，肝癌及神经胶质瘤的治疗[12-14]。但吉马酮在肺癌中的作用还未见报道，需要进一步研究。本文的主要目的是探索吉马酮对人非小细胞肺癌NCI-H1770细胞增殖，凋亡，侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞系来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。培养基 DMEM、胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司。CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自Solarbio。Transwell小室及人工基底膜购自美国BD公司。抗细胞增殖核抗原-67(antigen identified by monoclonal antibody,Ki67)抗体、抗Cleaved Caspase-3抗体和抗血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物处理 非小细胞肺癌细胞于添加了10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO2的恒温培养箱中培养。细胞增殖到80%左右时，进行传代培养。非小细胞肺癌细胞分为4组：对照组，吉马酮(5、10、20 μmol/L)组。对照组用DMSO进行处理。

1.2.2CCK-8检测细胞活力及增殖 不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的吉马酮处理非小细胞肺癌细胞48 h后，利用CCK-8按照试剂盒说明书检测不同处理浓度下的细胞活力。低中高剂量(5、10、20 μmol/L)吉马酮处理非小细胞肺癌细胞0、1、2、3、4 d后，按照试剂盒说明书通过CCK-8检测不同时间点NCI-H1770细胞增殖倍数。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 吉马酮处理48 h 后收集各组待测细胞，经PBS洗涤后用1×的Binding buffer将细胞制成1×106个/ml的悬液。然后加入Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，室温，避光，轻轻地混匀，孵育10 min。再加入碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，室温，避光，孵育5 min。最后利用流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.2.4Transwell检测细胞侵袭 首先将各组待测细胞用无血清的培养基制成细胞密度为1×106个/ml的悬液，然后将上述细胞悬液加入铺有人工基底膜的Transwell的上室中，同时在下室中加入含20%胎牛血清的培养基。37℃培养24 h后，用苏木精对上室底部细胞进行染色，并用棉签将上室内侧的细胞除去。显微镜下观察并统计细胞数量。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移 首先用10 μg/ml的丝裂霉素C处理各组细胞1 h后，将各组待测细胞制成1×106个/ml的细胞悬液，加入6孔板中，过夜培养至形成单层细胞。在单层细胞上用10 μl的枪头划横线，PBS洗3次，除去因划痕而脱落的细胞。显微镜下拍照测量划痕宽度，培养24 h后再取出拍照测量划痕宽度，计算划痕愈合率。

1.2.6蛋白印迹检测Ki67、Cleaved Caspase-3和VEGF表达 先用PBS将各组待测细胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，100℃变性5 min。等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，5%的BSA封闭1 h，加入相应的一抗，4℃过夜孵育。第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，各组间进行单因素方差分析后再进行Duncan′s multiple range test检验。P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞活力的影响 通过CCK-8检测细胞毒性，分析吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770、A549细胞活力的影响。图1显示，当吉马酮浓度<20 μmol/L时，NCI-H1770和A549细胞活力维持在80%以上。当吉马酮浓度≥20 μmol/L时，NCI-H1770细胞活力急剧下降，降到80%以下。上述结果说明，低浓度(<20 μmol/L)的吉马酮不会对非小细胞肺癌细胞产生毒性，高浓度(≥20 μmol/L)的吉马酮会急剧减弱非小细胞肺癌细胞活力。

2.2吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞增殖的影响 为分析吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770细胞增殖的影响，利用CCK-8检测不同时间点的细胞增殖倍数。如图2所示，吉马酮(10、20 μmol/L)组细胞增殖倍数低于对照组(P<0.01)。

图1 CCK-8检测细胞活力Fig.1 Cell viability was detected by CCK-8

图2 CCK-8检测细胞增殖Fig.2 Cell proliferation was measured by CCK-8Note: **.P<0.01 vs control group.

图3 流式细胞术检测细胞凋亡Fig.3 Apoptosis was tested by flow cytometryNote: **.P<0.01 vs control group.

以上结果表明,吉马酮可降低非小细胞肺癌增殖能力。

2.3吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞凋亡的影响 通过流式细胞术分析吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770细胞凋亡的影响。由图3可知，吉马酮(5、10、20 μmol/L)组细胞凋亡率高于对照组(P<0.01)。由此可见，吉马酮可提高非小细胞肺癌NCI-H1770细胞凋亡。

图4 Transwell检测细胞侵袭Fig.4 Cell invasion was detected by TranswellNote: **.P<0.01 vs control group.

图5 划痕实验分析细胞迁移Fig.5 Cell migration was measured by wound healingNote: **.P<0.01 vs control group.

图6 蛋白印迹检测增殖、凋亡及运动相关蛋白表达Fig.6 Expression of proliferation,apoptosis and motility related proteins was tested by Western blotNote: **.P<0.01 vs control group.

2.4吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770细胞侵袭的影响 利用Transwell检测细胞侵袭，分析吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770细胞侵袭的影响。图4显示，吉马酮(5、10、20 μmol/L)组每个视野下的侵袭细胞数目低于对照组(P<0.01)。上述结果说明，吉马酮可减弱非小细胞肺癌NCI-H1770细胞侵袭能力。

2.5吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞迁移的影响 为分析吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770细胞迁移的影响，利用划痕实验检测细胞迁移。如图5所示，吉马酮(5、10、20 μmol/L)组划痕愈合率低于对照组(P<0.01)。以上结果表明，吉马酮可降低非小细胞肺癌NCI-H1770细胞迁移能力。

2.6吉马酮对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及运动相关蛋白表达的影响 通过蛋白印迹检测Ki67,Cleaved Caspase-3和VEGF表达，分析吉马酮对非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞增殖，凋亡及运动相关蛋白表达的影响。由图6可知，与对照组相比，吉马酮(5、10、20 μmol/L)组Ki67和VEGF的相对蛋白水平下降，Cleaved Caspase-3的相对蛋白水平上升(P<0.01)。由此可见，吉马酮可减轻非小细胞肺癌NCI-H1770细胞增殖，凋亡及运动相关蛋白表达的异常。

3 讨论

肺癌也是中国最为普遍的癌症，2015年中国新增肺癌病例73.3万。肺癌死亡病例61万[15]。而且肺癌给患者家庭带来了严重的经济负担，开发有效的低成本肺癌治疗方法迫在眉睫[16]。大量研究表明各种植物提取物可用于各类癌症的治疗[17,18]。

细胞增殖的不受控是各种癌症的普遍症状。越来越多的研究表明植物提取物在抗癌细胞增殖方面发挥着积极作用。据报道迷迭香提取物可降低非小细胞肺癌A549细胞活力，抑制细胞增殖[19]。有研究显示吉马酮可抑制乳腺癌细胞活力[20]。Wang等[21]发现吉马酮可抑制结肠直肠癌细胞增殖。另外，吉马酮还可抑制耐阿霉素慢性髓细胞性白血病细胞活力，增强阿霉素对细胞增殖的抑制作用[22]。本文结果显示，低浓度(<20 μmol/L)的吉马酮不会对非小细胞肺癌细胞产生毒性，高浓度(≥20 μmol/L)的吉马酮会急剧减弱非小细胞肺癌细胞活力。吉马酮可降低非小细胞肺癌细胞增殖能力，减弱Ki67表达。

各种癌症中常常会出现细胞凋亡的异常，大量数据表明植物提取物可促进癌细胞凋亡。Yoon等[23]发现儿茶素-7-O-木糖苷可促进非小细胞肺癌H1299细胞凋亡，增强Caspase-6表达。有数据显示吉马酮可诱导神经胶质瘤细胞周期停留在G1期，促进细胞凋亡，提高Bax表达，降低Bcl-2表达[13]。有研究发现吉马酮可提高乳腺癌细胞凋亡，增强Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9表达[24]。据报道吉马酮可诱导肝癌细胞凋亡，增强Bax表达，减弱Bcl-2表达[14]。本研究结果显示，吉马酮可促进非小细胞肺癌细胞凋亡，提高Cleaved Caspase-3蛋白水平。

细胞侵袭和迁移在癌症发生发展过程中至关重要，越来越多文献报道植物提取物具有抑制癌细胞侵袭和迁移的功效。有数据显示桑橙素可抑制非小细胞肺癌A549细胞侵袭和迁移，减弱MMP-2和MMP-9表达[25]。有研究发现石榴叶提取物可降低非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移，抑制MMP-2和MMP-9表达[26]。

据报道丹参醌ⅡA可减弱非小细胞肺癌A549细胞侵袭和迁移，降低VEGF表达[27]。吉马酮在细胞侵袭和迁移方面的研究还较少。Lim等[12]发现吉马酮可抑制乳腺癌细胞迁移。本文结果显示，吉马酮可减弱非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移，降低VEGF表达。

本研究表明，在人非小细胞肺癌NCI-H1770和A549细胞中，吉马酮处理可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，降低细胞侵袭和迁移，减弱Ki67和VEGF表达，提高Cleaved Caspase-3蛋白水平。下一步计划在体内研究吉马酮对非小细胞肺癌肿瘤发生发展的影响，为开发有效的低成本的肺癌治疗方法提供理论依据。