正交试验和人工神经网络模型优化通痹凝胶贴剂提取工艺

马建春，李勇

(1.广东药科大学附属第一医院药学部，广东 广州 510080；2.广东药科大学临床药学系，广东 广州 510006；3.广东药科大学药物研究所，广东省药物新剂型重点实验室，广东 广州 510006)

中药新药通痹凝胶贴剂由秦艽、 制草乌等中药组成，具有祛风、 除湿、 散寒的功效，主治风、湿夹杂之寒痹症。秦艽中所含的环烯醚萜苷类化合物龙胆苦苷具有明显的镇痛抗炎作用[1]。制草乌所含的乌头类生物碱具有镇痛、抗炎等药理作用[2]。由于中药复方为多成分复杂体系，单一指标变化趋势难以体现复方整体质量，因此本实验以龙胆苦苷含量、乌头总生物碱含量、总固体得率等为评价指标。为体现各指标在提取结果分析中的作用，分析3个指标的权重系数，利用反向传播人工神经网络(BP-ANN)模型对正交试验得到的提取工艺进行仿真优化，最终确定最佳提取工艺。本研究将层次分析(AHP)法、CRITIC法、正交试验、BP-ANN等方法联合应用，为中药复方提取工艺优化提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV-2450紫外-可见分光光度仪(日本岛津公司)；CPA225D型电子分析天平(北京Sartorius公司)。

1.2 药物及试剂 秦艽、制草乌等药材购自广州致信药业有限公司，符合《中国药典》2015年版有关规定；对照品龙胆苦苷(批号：110770-201013)、乌头碱(批号：110720-201111)均购自中国食品药品检定研究院(供含量测定用)；液相用甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；液相用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液制备 按通痹贴剂处方药物组成及比例，称取秦艽、制草乌等药材，按照正交试验各条件进行提取，滤液滤过，定容至500 mL，作为样品溶液。

2.2 总固体测定 精密量取“2.1”项下样品溶液，置干燥至恒重蒸发皿中，在水浴上蒸干后，置烘箱中105 ℃干燥5 h，后移至干燥器中，冷却30 min，再于105 ℃干燥1 h，冷却，称重，直至恒重，计算总固体得率。

总固体得率(%)=干燥后固体重量/药材重量×100%。

2.3 总生物碱含量测定[3]对照品溶液的制备:精密称取乌头碱对照品10.03 mg至量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶解并定容至10 mL，得乌头碱对照品溶液。

测定:取对照品溶液及样品溶液各1.0 mL，分别置于分液漏斗中，加乙酸钠缓冲液5.0 mL与溴甲酚绿指示剂2.0 mL，后加超纯水至10.0 mL，混合均匀。再精密加入三氯甲烷10.0 mL，充分振摇3 min，静置10 min后，取下层三氯甲烷液，滤过，弃去初滤液，收集续滤液至已放入0.5 g无水硫酸钠的试管中，密塞，静置30 min，于紫外-可见分光光度计415 nm波长处测定吸光度，计算乌头总生物碱含量。

2.4 龙胆苦苷含量测定[4]对照品溶液的制备:精密称取龙胆苦苷对照品14.02 mg至量瓶中，加甲醇溶解并定容至20 mL，得龙胆苦苷对照品溶液。

供试品溶液制备:精密吸取“2.1”项下样品溶液1 mL，加甲醇稀释并定容至20 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

阴性供试品溶液制备:按处方药物比例，按照“2.1”项下制备方法，制备不含秦艽药材的阴性样品溶液。精密吸取阴性样品溶液，加甲醇稀释并定容至20 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，得阴性供试品溶液。

色谱条件:色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%醋酸溶液(9∶91，V/V)；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；理论塔板数以龙胆苦苷峰计算应不低于3 000。结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相同保留时间处，具有相应的色谱峰，且阴性无干扰，色谱图见图1。

A.龙胆苦苷对照品；B.供试品；C.阴性供试品图1 龙胆苦苷HPLC色谱图

2.5 各指标权重分析 参考文献[5-6]，采用AHP法结合CRITIC法对龙胆苦苷、乌头总生物碱、总固体得率等3个指标建立综合权重。

AHP权重系数的确定：根据通痹凝胶贴剂中药物君臣佐使配伍规律，乌头总生物碱、龙胆苦苷及药效作用强弱，将乌头总生物碱、龙胆苦苷、总固体得率这3个指标分成3个层次进行量化，按照乌头总生物碱>龙胆苦苷>出膏率的顺序进行排序，构建不同指标组合的比较优先矩阵，并计算各项指标的相对评分。经过计算，乌头总生物碱、龙胆苦苷、总固体得率的AHP法权重系数分别为0.389、0.354、0.257。一致性比较因子CI=0.04，一致性比率CR=0.06，均<0.1，表明指标优先比较判断矩阵具有一致性。

CRITIC法权重系数的确定：将正交试验各指标9组数据经线性插值处理[指标成分=(该实验指标成分含量-最低含量)/(最高含量-最低含量)×100]，消除单位量纲后，计算乌头总生物碱、龙胆苦苷、总固体得率各指标对比强度(si)、冲突性(δi)、综合权重(ci)与权重(ωi)。经CRITIC法后得到乌头总生物碱、龙胆苦苷、总固体得率的权重系数分别为0.425、0.335、0.240。

AHP-CRITIC混合加权法确定权重：AHP法得到了以主观信息为基础的权重系数，CRITIC法求得相应指标的客观权重系数，将两种系数综合，得到3个指标成分的综合权重。综合权重公式为ω综ij=ωAHP-ijωCRITIC-ij/∑ωAHP-ijωCRITIC- ij。经过计算，乌头总生物碱、龙胆苦苷、总固体得率的综合权重分别为0.526、0.344、0.130，即综合评分=(乌头总生物碱测得含量/乌头总生物碱最高含量)×0.526×100+(龙胆苦苷含量/龙胆苦苷最高含量)×0.344×100+(总固体得率/总固体最高得率)×0.130×100。

2.6 正交试验设计及结果 根据文献报道[4，7]及预实验结果，本研究采用L9(34)正交试验设计通痹凝胶贴剂提取工艺，以乌头总生物碱含量、龙胆苦苷含量、总固体得率为指标，对影响提取效率的4个因素乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取次数(C)及提取时间(D)等进行正交试验，试验设计及结果见表1。

表1 通痹凝胶贴剂正交试验结果

表2 正交试验方差分析

注：*F0.05(2,2)=19.00

由表1正交试验结果可知，影响通痹凝胶贴剂提取工艺的因素由大到小依次为：C>B>A>D，表2方差分析结果表明提取次数在各水平间具有显著性差异，是影响通痹凝胶贴剂提取的主要因素。最佳工艺组合为A1B3C2D3，即药材加12倍量60%乙醇提取2次，每次2 h。

2.7 BP神经网络建模与应用[8-10]

2.7.1 BP-ANN模型构建 采用Matlab R2014a数学软件(美国MathWorks公司)构建 N为隐含层的4-N-1型BP神经网络模型，以乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间这4个影响因素数据为输入层，以综合评分为输出层，构建提取工艺仿真优化模型，神经网络图见图2。

图2 BP神经网络运行模型

2.7.2 BP神经网络的运行

2.7.2.1 神经网络模型测试 将表1的9组数据导入BP神经网络模型，其中随机抽取7组数据用于模型训练，剩余2组数据用于模型测试。通过对不同神经元数进行训练，得知当隐含层节点数为10时，其中训练函数为trainlm，最大训练迭代次数为500，隐含层神经元的传递函数为tansig，输出层神经元的传递函数为 purelin，其他各项参数为默认值时，2组预测数据的输出值与实际值相对误差小于1.5%，表示该神经网络模型训练与预测精度较好，满足试验要求。

2.7.2.2 神经网络模型最佳工艺的仿真优化 对正交试验中乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间4个因素的3个水平进行任意组合，可得到64种不同组合。将这64种组合作为输入值，用“2.7.2.1”项下构建的神经网络模型进行仿真优化。通过对输出层的综合评分结果进行筛选，最终确定通痹凝胶贴剂的最优提取工艺为：药材加10.8倍量67%提取2次，每次1.7 h。

2.8 验证试验 分别按照正交试验及BP神经网络优化得到的提取工艺进行提取工艺验证，平行3次。应用正交试验得到提取工艺的综合评分平均值为94.74，按照BP神经网络优化得到的提取工艺条件的综合评分平均值为95.03，两种提取工艺综合评分接近，但BP神经网络优化的提取工艺具有乙醇用量少、提取时间短、能耗低的优点。

3 讨论

3.1 目前中药制剂一般采用多指标优选提取工艺，但多数研究对各指标的权重赋值采用主观法，不能真实反映各指标对提取效率的贡献。AHP法结合CRITIC法确定指标权重系数是比较可靠的方法。其中AHP法将不同指标之中任意两个指标间的优先信息进行了量化，在遵循中药配伍原则的基础上得到了偏向于主观评价的权重系数，初步揭示了各指标的权重系数。CRITIC法以评价指标间的对比强度和冲突性为基础，能够反映各指标的客观权重[5-6]。为保证各指标的权重准确性，将主观指标与客观指标相结合，计算综合权重，工艺评价结果会更加客观、真实，优选的工艺更适于工业化生产。

3.2 正交试验作为中药提取优选最常用的方法，是用部分试验代替全面试验，不能对各因素变化情况进行全面分析，当试验因素和水平较多的情况下，试验次数会成倍增加。利用人工神经网络技术的预测与推断能力，通过建立某种简单模型，运用自组织和实时学习的优点，模拟中药提取、纯化、成型等工艺中各种因素的变化趋势，分析数据间效应、交互作用，获得不同因素的最优组合，节约研究时间与成本。本研究将正交试验与人工神经网络技术结合，仿真优化提取工艺条件，得到的工艺条件具有提取效率高、能耗低的优点。