传染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增检测方法的建立和初步应用

何亚鹏，陈怡静，时 晓，张宝莉，温战华，陈春山，李 博，杜迎春

(1.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102100；2.郑州外国语新枫杨学校，郑州450000)

传染性造血器官坏死病(infectious haematopoietic necrosis，IHN)是极易对冷水鱼养殖造成严重危害的鱼类急性全身性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)规定必须申报的动物疫病，我国农业部也将其列为二类动物疫病，是第1类鱼类口岸检疫疫病[1]。目前，该病在法国、意大利、德国、英国、日本、韩国、俄罗斯和中国等国家暴发，已形成全球分布；在我国，自1985年东北地区首次报道IHN以来，该病在北京、河北、辽宁、吉林、山东、甘肃、青海、四川、新疆、云南等省、市、自治区均有分布，并有向周围蔓延的趋势[2-4]。IHN的病原为弹状病毒科诺拉弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)，其病毒形态为子弹状，有囊膜包被[4]。IHNV主要危害鲑鳟鱼类的鱼苗及幼鱼，鱼苗死亡率极高，可达100%[1，3]。

IHN可通过临床和病理诊断进行初步判断，确诊则需要进一步的实验室检测。目前检测IHNV的方法主要病毒分离培养、抗体中和试验、免疫组化法、ELISA以及RT-PCR等方法。这些方法一般费时费力，且对试验平台要求很高，需要一些专业的设备[5-7]。逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)节省实验步骤，具有操作简便、快速、特异性强等优点，不需很专业的仪器设备，在水浴锅中即可完成扩增，特别适用于基层及现场快速诊断[8]。本研究针对IHNV的保守序列核蛋白基因N的特定区域设设计3对特异性引物，并在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，建立了简单、快速、灵敏度高、特异性好的IHNV检测方法，丰富了实验室和现场检测IHNV的手段，对IHN快速诊断及防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒RNA提取试剂盒StarSpin Viral RNA Kit购于北京康润诚业生物科技有限公司；反转录试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司；DNA Marker、2×Es Taq MasterMix购于北京康为世纪生物科技有限公司；10×ThermoPol反应缓冲液、Bst 2.0 DNA聚合酶和AMV反转录酶购自NEB公司；IHNV BJSY株(Genbank登录号：MH374162)由本实验室分离保存，鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carpvirus，SVCV)、牙鲆弹状病毒(hirame rhabdovirus virus，HRV)灭活病毒液购自ATCC，病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)灭活病毒购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 RT-LAMP引物设计与合成

对GenBank 收录的IHNV N基因的多条基因序列进行比对，选取特异性保守区段，利用在线软件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)针对N基因保守区设计3对RT-LAMP专用引物，序列见表1，引物由华大基因公司合成。将引物均稀释为20 pmol/μL，-20 ℃保存备用。

表1 N基因RT-LAMP引物序列

1.3 病毒RNA的提取

取200 μL病毒液于无RNA酶的离心管中，用StarSpin病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA，分装，使用A one超微量全光谱分光光度计(北京同立创辉仪器有限公司)，测定提取到的病毒样品的RNA浓度，用DEPC处理水稀释RNA样品为10 μg/μL，置于-80 ℃备用。

1.4 RT-LAMP检测方法的建立及优化

建立25 μL的RT-LAMP扩增反应体系。体系包含对应于N基因的6 条引物：F3-N与B3-N各0.5 μL；FIP-N与BIP-N各2 μL；LF-N与LB-N各1 μL、dNTP(10 nmol/L) 2.5 μL，10×ThermoPol 反应缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L(NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100] 2.5 μL，8 U Bst 2.0 DNA 聚合酶，10 U AMV 反转录酶，1 μL IHNV的RNA样品(10 μg/μL)，无RNA 酶水补齐至25 μL，混匀，同样的体系设立5个样品，编号1～5。将5个样品分别在61、62、63、64、65 ℃恒温水浴锅反应35 min，随后都转移至80 ℃水浴2 min用以灭活Bst DNA聚合酶。反应结束后，扩增产物各加入1 μL 50倍稀释的SYBR Green I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化判断结果。取5 μL产物用于1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，确定最佳反应温度。

1.5 RT-LAMP特异性实验

分别取IHNV、SVCV、HRV 和VHSV基因组RNA(10 μg/μL)各1 μL为模板，分别构建RT-LAMP体系，利用建立的RT-LAMP检测方法，进行特异性对比实验，同时以去离子水为模板，相同体系和条件反应作为阴性对照。扩增结束后产物加入1 μL 50倍稀释的SYBR Green I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对比检测结果。

1.6 RT-LAMP灵敏性实验

将提取的IHNV的RNA(10 μg/μL)10倍梯度稀释成浓度为1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5μg/μL的病毒RNA,各取1 μL分别构建RT-LAMP体系，采用优化过的条件进行检测，进行灵敏性试验。扩增产物加入1 μL 50倍稀释的SYBR Green I，轻轻震荡，直接观察反应液颜色变化，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对比检测结果，得出该方法能检测出的IHNV的核酸的最低浓度。

1.7 重复性试验

利用建立的RT-LAMP 检测方法，在不同时间，对同一阳性IHNV的RNA样品进行检测，以验证本方法的稳定性。

1.8 RT-LAMP的临床检测

从河北省多个虹鳟鱼养殖场采集疑似患IHN的幼鱼，挑选9条分别采集肝组织，用StarSpin病毒RNA提取试剂盒提取RNA，编号1～10，分别取1 μL的1～10号RNA样品利用本试验建立的IHNV的RT-LAMP进行检测，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证检测结果；同时该1～10号RNA样品利用之前已经建立的IHNV的RT-PCR方法进行检测[9]，先用反转录试剂盒将提取的RNA进行反转录，然后以反转录产物为为模板，上游引物为5′-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3′，下游引物为5′-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3′，目的片段为825 bp，PCR 程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，25个循环；72 ℃再延伸5 min，然后将扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。观察结果，对比分析该方法在临床检测上的适用性。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP反应温度的优化

将5组25 μL反应体系分别在61、62、63、64、65 ℃恒温水浴锅反应35 min，随后转移至80 ℃水浴2 min，加入1 μL 50倍稀释的SYBR Green I，混匀，观察颜色变化。结果显示，当扩增温度为61、62 ℃时扩增产物加入SYBR Green I后仍为SYBR Green I的原始颜色红棕色(图1a)，电泳没有出现阶梯状电泳条带(图1b)；在63、64 和65 ℃时扩增产物加入SYBR Green I后变为荧光绿色(图1a)，电泳出现阶梯状电泳条带(图1b)。该显色结果与凝胶电泳结果相符，进行3次重复试验，结果一致，表明该方法在温度为63、64 和65 ℃可以有效扩增。本试验采用64 ℃为该方法最佳扩增温度。

图1 RT-LAMP反应条件优化结果

2.2 RT-LAMP特异性实验

IHNV、SVCV、HRV和VHSV同属水生动物弹状病毒，病毒基因组结构相似，IHNV和VHSV均可感染鲑鳟鱼类，RT-LAMP方法也容易受到相似核酸模板和一些污染物的干扰，出现假阳性扩增[8-9]。因此本试验利用SVCV、HRV、VHSV和ddH2O作对照检测该RT-LAMP检测方法的特异性。结果显示，以IHNV的RNA为模板，进行RT-LAMP扩增后，产物加入SYBR Green I混匀变为荧光绿色(图2a)，凝胶结果呈特异性阶梯状条带(图2b)；以SVCV、HRV、VHSV和ddH2O为模板相同体系和条件进行RT-LAMP检测，产物呈红棕色(图2a)，凝胶电泳无特异性阶梯状条带出现，结果为阴性(图2b)。进行3次重复试验，结果一致，说明本试验建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性。

图2 RT-LAMP特异性检测结果

2.3 RT-LAMP灵敏性实验

分别以1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5μg/μL的IHNV的RNA为模板，利用建立的RT-LAMP检测方法，分析该检测方法的灵敏性。扩增产物加入SYBR Green I后观察颜色变化，取5 μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察验证可视化检测结果。结果显示，当病毒RNA浓度为1.0～1.0×10-4μg/μL时，取1 μL为模板，进行RT-LAMP反应，产物在加入SYBR Green I 后变成荧光绿色(图3a)，电泳特异性阶梯状条带(图3b)，当1.0×10-5μg/μL，产物加入SYBR Green I ，颜色不变，仍为红棕色(图3a)，电泳未出现特异性阶梯状条带(图3b)，进行3次重复试验，结果一致，说明本试验建立的RT-LAMP检测方法具有较高的灵敏度，可以检测浓度不低于1.0×10-4μg/μL的IHNV的RNA。

图3 RT-LAMP灵敏性试验检测结果

2.4 重复性试验

经过3次重复性试验，结果均一致，证明本试验所建立的RT-LAMP检测方法具有良好的重复性和稳定性。

2.5 RT-LAMP临床应用检测结果

临床上采集的10个样品提取的的RNA样品利用本试验建立的IHNV的RT-LAMP进行检测，同时利用之前已建立的IHNV的RT-PCR检测方法作为对比试验，结果表明，4号、9号样品呈现荧光绿色，样品中检出IHNV，其余8个样品检测结果呈红棕色(图4a)，未检测出IHNV，琼脂糖凝胶电泳结果也表明4号、9号样品出现电泳特异性阶梯状条带(图4b)，为IHNV阳性，其余8个样品为阴性。该实验结果与之前已建立的检测IHNV的RT-PCR方法的结果一致，4号、9号样品出现825 bp的条带(图4c)，证明了该RT-LAMP方法可在临床上进行应用。

图4 临床样品检测结果

3 讨论

我国近几年冷水鱼养殖发展迅速、前景广阔，但IHN在我国多地的冷水鱼养殖场持续爆发，由我国东北、东部、中部各省市向西北、西南各省蔓延，对冷水鱼养殖业造成严重威胁[1,3]。为保障我国冷水鱼养殖业的健康发展，需要警惕IHN的爆发，采用先进方法快速确定病原，及时做好防控。LAMP技术由于其简单易于操作，结果可靠，所以逐步被广泛应用于病原体检测，国内外已建立多种检测病毒的LAMP方法[10,11]。该方法利用特异性识别靶序列的3对引物及一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，可以在恒温条件进行核酸的指数级扩增，克服了PCR方法需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，避免了对PCR仪的依赖，节省了反复升降温的时间[8]。本试验针对IHNV的保守序列核蛋白基因N的特定区域设计3对特异性引物，建立IHNV的反转录LAMP检测方法，优化反应温度，选取64 ℃为该方法最佳扩增温度；在特异性实验检测中，利用IHNV与3种同属水生动物弹状病毒(SVCV、HRV、VHSV)提取的核酸进行特异性实验，IHNV能在短时间内检测出来，而同属水生动物弹状病毒均无扩增；灵敏度试验结果表明本RT-LAMP检测方法最低可检出1.0×10-4μg/μL的IHNV核酸，与RT-PCR检测方法的灵敏度相当；临床上检测效果很好，适合推广应用。

RT-LAMP方法可以利用荧光染料直接染色，并通过染料颜色的变化或者凝胶电泳方法判定结果。有研究利用浊度分析仪检测LAMP的焦磷酸盐沉淀来判定检测结果，但在实际中使用该方法的检测灵敏度较差，不如荧光染料法和电泳法[12]。因此本试验采用荧光染料法和电泳法结合进行结果分析，更能直观地观察到待测样品的检测结果，相互验证。LAMP方法简单快捷，具有很多优点，适用于基层及现场快速诊断，但由于LAMP方法的扩增非常高效，容易使空气中很容易形成核酸片段的气溶胶污染，在封闭环境长期检测同类样品时容易出现假阳性，因此需要特别注意，防止管内的核酸片段扩散到封闭环境的空气中[12]。所以如果需要封闭环境长期检测同类样品，可以在进行反应之前将稀释的SYBR Green I小心加到装有样品的PCR管盖上，待反应结束后，不开盖，直接离心，SYBR Green I落入管底，漩涡震荡混匀即可观察颜色变化，这样可防止开盖引起的气溶胶污染，避免假阳性的出现。

综上所述，本研究建立的检测IHNV的RT-LAMP检测方法，具有操作简便、快速、灵敏度高等优点，不需很专业的仪器设备，在水浴锅中即可完成扩增，适用于基层及现场快速诊断，丰富了实验室和现场检测IHNV的手段，对鲑鳟鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育、鲑鳟无公害健康养殖，以及IHN的快速检测及防控均有重要意义。