衣原体包涵体膜蛋白的结构特征及生物学功能研究进展

衣原体属家族成员为专性细胞内寄生菌，主要包括原体(Elementary body, EB)和网状体(Reticulate body, RB)两种形态。根据16S rRNA和32S rRNA的序列相似性将其分为12个种[1]，其中对人致病的主要有沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis, Ct)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci, Cps)及肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae, Cpn)。前者可致盲，是性传播疾病的主要致病菌，后两者主要引起呼吸道感染。

在感染细胞内，衣原体在一种被称为包涵体的膜隔室内进行生物合成和组装。该膜隔室(包涵体)可为衣原体提供复制微环境，此外衣原体营养物质的获取也需通过包涵体。感染性EBs进入易感细胞后，一系列由衣原体编码的蛋白将对包涵体进行修饰以逃逸宿主内吞途径并在宿主细胞内稳定生存[2]。这是衣原体在细胞内完成复制周期的必要条件。

包涵体膜蛋白(Inclusion membrane protein, Inc蛋白)为衣原体基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretory system, T3SS)效应蛋白，经由T3SS转位并插入包涵体膜后可对包涵体进行广泛修饰[3]。这些修饰包涵体的蛋白位于宿主-衣原体相互作用界面，可作为分子桥梁介导宿主与衣原体的相互作用，因而必定在衣原体的致病机制中发挥重要作用。近年来，Inc蛋白一直是衣原体研究领域的重点，因此，本文对Inc蛋白的研究进展进行了综述。

1 包涵体膜蛋白的结构特征

Inc蛋白的发现最初源于Rockey等[4]对细胞内发育阶段中特有衣原体蛋白的探究。其使用康复期感染动物的抗血清对Cps DNA进行了筛选，结果表明存在一种蛋白产物(被命名为IncA)定位于包涵体膜。随后在Ct中用同样的方法鉴定出了IncA[5]。Scidmore-Carlson等[6]使用免疫血清检测衣原体的表达文库，成功识别了IncD、IncE、IncF、IncG这4种新的Inc蛋白。其次，在T3SS的研究[7]及宿主细胞胞质免疫蛋白酶体加工[8]中也鉴定出了Inc蛋白。

Inc蛋白对包涵体的广泛修饰可使包涵体避免与内吞囊泡融合而逃逸宿主内吞。不同Inc蛋白的一级结构存在较大的差异，但Bannantine等[9]对当时已证实为Inc蛋白的Ct和Cpn IncA及Cps IncA、IncB、IncC的氨基酸序列进行了疏水性分析，结果表明这些Inc蛋白的疏水性图谱中均含有一个大约为50个氨基酸的双叶疏水结构域。并应用血清学方法进一步证实了其它几种含有该结构域的蛋白也定位于包涵体膜。随后，Toh等[10]应用该特征性结构域分别预测了90种Cpn假定Inc蛋白和36种Ct假定Inc蛋白。其中部分假定Inc蛋白也在随后的研究中被证实存在于包涵体膜上[11-12]。2011年，Dehoux等[13]应用异源分泌系统证实90%的Ct和Cpn假定Inc蛋白的N末端为功能性TTS信号。并应用生物信息学方法对假定Inc蛋白进行分析，结果表明Inc蛋白的双叶疏水结构域由两个大约含有15～32个氨基酸残基的跨膜 α 螺旋构成，并且这两个跨膜结构域被一个短链环连接(3～22个残基)。此外，在一些Inc蛋白中也发现存在有一个由大约180个氨基酸组成的ADP核糖结合结构域，即A1pp结构域。由于存在该结构域，细菌可将NAD+代谢物或ADP-核糖基化蛋白募集至包涵体膜，进而完成各种生物学功能。还有一些Inc蛋白中存在卷曲螺旋结构(如IncA)，该结构可能在Inc蛋白与宿主蛋白的相互作用中发挥了重要功能。

Inc蛋白可通过特征性双叶疏水结构域插入包涵体膜，且这些蛋白的两个末端(N末端和C末端)朝向胞质，其中大部分Inc蛋白的N末端含有可介导Inc蛋白转位至包涵体膜的TTS信号[13]，而多数研究均显示C末端内含有与宿主细胞相互作用的特异性结构域[14-20]，如IncA的可溶性NSF附着蛋白受体(Soluble NSF attachment protein receptor, SNAREs)样基序、IncV的FFAT样基序及Cpn0585的Rab GTPase结合蛋白结构域。因而，衣原体可通过Inc蛋白与宿主的相互作用来调节自身在宿主细胞内的生存。

2 包涵体膜蛋白的生物学功能

特征性的双叶疏水结构域使Inc蛋白能够插入包涵体膜，并且朝向胞质的Inc蛋白C末端可与宿主蛋白相互作用，从而在衣原体营养摄取、细胞内生存及子代原体的释放等多个方面发挥重要作用(图2)。

2.1控制宿主细胞的囊泡转运途径 为了建立和维持利于自身生存和复制的微环境，衣原体可利用多种宿主细胞过程，其中包括囊泡转运途径。囊泡转运途径是细胞内膜包裹细胞器之间物质转运的主要方式。Rab GTPases为囊泡转运途径的主要调节器，在物质的囊泡转运中发挥重要作用[21]。已有研究表明，衣原体可将多种Rab GTPases募集至包涵体，包括Rab4/11/14(内吞途径)[22]、Rab1/6/10(ER-Golgi相关途径)[22]和Rab39[23]。Inc蛋白在这些Rab GTPases的募集中发挥了重要作用，其中Ct Inc蛋白CT229为Rab4的相互作用蛋白，可将Rab4募集至包涵体[24]，而Cpn Cpn0585可募集多种Rab蛋白至包涵体，包括Rab1、10和11[14]。在某些情况下，Rab结合蛋白也能被直接募集至包涵体膜，如BICD1(Rab6相互作用蛋白)能以不依赖Rab6的方式被募集至包涵体，表明Inc蛋白能直接募集BICD1[25]。通过募集这些Rab GTPases及其相互作用蛋白，衣原体可利用囊泡转运途径获取自身所需的营养物质及进行囊泡转运[26]。除能募集Rab GTPases外，衣原体还能将宿主SNAREs蛋白募集至包涵体[25]。SNAREs蛋白是细胞内膜融合机制的关键组分，囊泡内的t-SNAREs可与靶细胞器内的v-SNAREs形成四聚体螺旋结构促进膜的融合[27]。衣原体中多种Inc蛋白含有SNAREs样基序，包括IncA、CT813和CT223[28]。其中IncA可促进包涵体的同型融合[19, 27-29]，并且介导包涵体同型融合的功能核心区即为SNARE样结构域[30]。但是，在包涵体与内 吞囊泡的相互作用中，IncA却能抑制包涵体膜与宿主内吞囊泡的融合[27]。此外，衣原体IncE可结合分选成分SNX5和SNX6，并募集这些逆向转运复合物成分至包涵体，以控制宿主的逆向囊泡转运途径[16, 31-33]。逆向囊泡转运复合物介导的过程参与了许多基础细胞过程，如溶酶体的生物合成、营养物质的获取及细胞信号的传导，因此，衣原体对逆向转运途径的操纵有利于衣原体的生存。包涵体也能以微管或动力蛋白依赖性方式被转运至高尔基体附近或微管组织中心(microtubule organizing center, MTOC)定位。Cps IncB[34]和Ct包涵体膜上特定微区域内的Inc蛋白(包括IncB、IncC、CT101、CT222、CT223、CT224、CT228和CT850[12])可参与该过程。其中IncB可将可溶性NSF附着蛋白相关蛋白(Soluble NSF attachment protein associated protein; Snapin)募集至Cps的包涵体膜上，包涵体膜上的Snapin蛋白与动力蛋白相互作用可介导包涵体沿微管网运动。而微区域存在Inc蛋白可募集活性Src家族激酶[35]。该激酶可促进微管成核及包涵体的动力蛋白依赖性运动，从而介导包涵体的细胞内运动。随后，Mital等[36]又进一步发现CT850可与动力蛋白轻链1(Dynein light chain Tctex-type 1, DYNLT1)发生相互作用，通过募集这些DYNLT1蛋白，包涵体在宿主细胞内的运动可被促进。

左图为Inc蛋白的模式图。右图中红色圆圈内即为氨基酸序列中双叶疏水结构域所在的部位。其中(a)～(f) 分别代表Ct IncA (CT119)、IncB (CT232)、IncC (CT233) 和Cpn IncA (Cpn0186)、IncB (Cpn0291)、IncC (Cpn0292)图1 Inc蛋白的特征性结构Fig.1 Characteristic structure of inclusion membrne proteins (Inc proteins)

图2 Inc蛋白的生物学功能Fig.2 Biological function of Inc proteins

2.2在非囊泡转运中的作用 除了靶向小GTPases、SNAREs和逆向囊泡转运复合物操纵宿主细胞器间的囊泡转运外，衣原体包涵体也可与宿主细胞器膜形成膜接触位点(Membrane contact sites, MCS)以应用宿主细胞的非囊泡转运途径。MCS是两个细胞器膜紧密接触的距离在10～30 nm之间的部位，其可介导细胞器间脂质和Ca2+的非囊泡转运[37]。衣原体包涵体可与内质网形成MCS，Inc蛋白在MCS中既可发挥结构性作用稳定MCS，也能发挥功能性作用将功能性成分募集至MCS。

Stanhope等[15]证实IncV(CT005)可发挥结构性作用介导MCS的形成，其中IncV所含有的FFAT样基序可与内质网驻留蛋白VAPs相互作用介导内质网-包涵体MCS形成。但IncV并不是介导MCS形成的唯一分子，还存在其它Inc蛋白也能在MCS的形成中发挥作用，因为IncV的缺失只能使MCS范围缩小，而不能使MCS形成缺失。

Inc蛋白除能介导MCS形成外，还能将功能性成分募集至MCS处发挥作用。有研究显示，IncD能将神经酰胺转运蛋白(ceramide transfer protein, CERT)募集至MCS处[38-39]。CERT为一种功能性成分，其可参与内质网-高尔基体MCS处鞘磷脂前体神经酰胺的非囊泡转运[40]。因此Isabelle等[38]猜测被募集到内质网-包涵体膜接触位点处的CERT也能作为功能性成分将神经酰胺从内质网转运至包涵体，转运至包涵体的神经酰胺能在包涵体内被进一步修饰成为鞘磷脂(其为衣原体复制所必需的脂质)，从而维持衣原体的正常发育周期。除CERT外，Ca2+感受器基质相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1, STIM1)也能被募集至内质网-包涵体MCS，并与CERT和VAPs共定位[41]。但内质网-质膜MCSs处的STIM1相互作用蛋白Orail并不定位于包涵体膜，表明可能存在Inc蛋白可模拟Orail将STIM1募集至包涵体，从而发挥相应生物学功能。

2.3维持宿主细胞存活 衣原体为专性细胞内寄生菌，其必须在宿主细胞内存活足够长的时间才能完成其发育周期。因此，衣原体进化出了一系列可避免宿主细胞死亡的机制，如衣原体感染可引起细胞凋亡抑制蛋白2(c-IAP2)稳定并能使促存活因子Mcl-1上调[42-43]。其次，Inc蛋白在维持宿主细胞存活中也发挥了重要作用。Ct Inc蛋白CT118(IncG)可与宿主14-3-3β蛋白发生相互作用并将其募集到包涵体膜上[44]。包涵体膜上的14-3-3β蛋白可与Raf-1、磷酸化Bad发生相互作用抑制宿主细胞凋亡，从而维持宿主细胞的存活。此外，Cpn Inc蛋白Cpn1027可将Wnt信号通路调节因子胞质活化/增殖相关蛋白2(Caprin2)及β-catenin降解复合物组分糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK3β)募集至包涵体[18]。这种相互作用可封闭β-catenin降解复合物，从而使胞质内的β-catenin累积。累积的β-catenin进而可激活多种Wnt靶基因以促进衣原体的抗凋亡活性。Ct Inc蛋白CpoS(CT229)可对抗STING介导的促细胞死亡作用和IFN-I型反应[45]。CopS的失活可诱导感染细胞快速凋亡和坏死。并且CpoS缺陷型衣原体可诱导由cGAS/STING/TBK1/IRF3信号通路所介导的强烈IFN-I型反应，从而引起细胞死亡。Weber等[46]也证实Ct的某些Inc蛋白是包涵体关键的结构性成分，对维持液泡的完整性至关重要。特异性Inc蛋白的缺失使包涵体膜易破裂，从而将细菌释放入细胞质，宿主细胞感知到细菌存在时就会启动凋亡途径，并最终导致宿主.细胞死亡。

2.4对宿主免疫应答的影响 衣原体可引起宿主细胞产生一系列反应以清除入侵的宿主病原体，同时，衣原体也进化出了一系列机制以逃逸宿主免疫应答。有研究表明Cpn的Inc蛋白CP0236可与宿主NF-κB激活剂1(Act1)蛋白相互作用并将其封存于包涵体膜上[47]。Act1蛋白为IL-17介导的信号通路的关键组分，其可激活下游的NF-κB因子，从而激活NF-κB信号通路，引起宿主免疫应答。当Act1蛋白被封存在包涵体膜上时，NF-κB的激活受阻，IL-17所介导的信号通路受损，从而引起宿主固有免疫和适应性免疫应答受抑制，该过程有助于衣原体在机体内生存复制。然而，Ct Inc蛋白Cap1(CT529)[48]和CrpA(CT442)[8]却有助于感染小鼠体内衣原体的清除。这两种Inc蛋白均为CD8+T细胞的靶蛋白，可经MHCⅠ类分子提呈给CD8+T细胞，从而激活机体的适应性免疫应答清除机体内衣原体。此外，这两者还能引起机体产生保护性免疫，将前者诱导产生的特异性T细胞注入小鼠体内可对感染小鼠产生极强的保护作用[48]，后者的重组蛋白经免疫接种后可使机体产生一定的保护性免疫[8]。

2.5调节子代原体的释放 在衣原体发育周期末，子代原体需从宿主细胞内释放以继续下一个感染周期。其中子代原体的释放主要涉及两个机制：细胞裂解和挤压释放[49]。细胞裂解涉及半胱氨酸蛋白水解酶类对包涵体膜和质膜的水解。而子代原体的挤压释放类似于胞吐过程，释放过程需要肌动蛋白、肌球蛋白和Rho家族GTP酶RhoA[49]。Lutter等[50]研究表明Ct Inc蛋白CT228可以通过将肌球蛋白磷酸酶复合物中的肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1)募集至包涵体膜微区域，从而调节EBs的挤压释放过程，但其并未阐述调节肌球蛋白磷酸酶活性的具体机制。随后Nguyen等[51]的研究阐明了肌球蛋白磷酸酶活性的调节机制。其表明Ct Inc蛋白MrcA(CT101)可与Ca2+通道1,4,5-三磷酸肌醇3型受体(inositol-1,4,5-trisphosphate receptor, type 3, ITPR3)相互作用，并将ITPR3募集至包涵体上富含活性Src家族激酶的微区域上。MrcA的缺失和ITPR3的抑制均可使衣原体挤压释放严重受损。此外，Ca2+通道ITPR3还可与Ca2+感受器STIM1作用调节储库中Ca2+的释放，使胞质内Ca2+浓度增加。Ca2+浓度的增加在促进肌球蛋白轻链2(myosin light chain2, MLC2)磷酸化的同时，也能激活Rho激酶(Rho-associated kinase, ROCK)，进而使MYPT1磷酸化(肌球蛋白磷酸酶活性下降)，从而维持肌球蛋白的动力活性以利于子代衣原体的挤压释放。

3 展 望

目前，对部分Inc蛋白在衣原体生长发育中的作用已经有了一定的认识，如Ct IncA可促进包涵体同型融合、IncD有利于衣原体所需脂质-鞘磷脂的获取、CT229及IncC等Inc蛋白可维持衣原体包涵体的稳定性、CT228及CT101等蛋白可调节衣原体子代的释放。但仍未完全清楚这些蛋白发挥生物学功能的具体机制，且在衣原体蛋白家族中仍然有许多假定的Inc蛋白未被实验验证，在已被证实定位于包涵体膜上的Inc蛋白中，仍然有绝大多数蛋白的生物学功能尚未被揭示。Inc蛋白在衣原体整个发育周期中具有重要的作用，其不仅能介导衣原体所需营养物质的获取，也能抑制宿主细胞死亡，但存在一些Inc蛋白可能有利于衣原体的细胞内清除。因此，接下来应加强对Inc蛋白的研究，深入探究Inc蛋白在衣原体致病中的作用及探索除Cap1和Crap外是否存在其它可介导保护性免疫产生的Inc蛋白，从而为揭示衣原体致病机制及研发衣原体疫苗提供理论依据。

利益冲突：无

本文引用格式：肖健, 王川, 吴移谋. 衣原体包涵体膜蛋白的结构特征及生物学功能研究进展[J]. 中国人兽共患病学报, 2019,35(4):338-344. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2692.2019.00.033