毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖

程 功，焦思明，冯 翠，贾培媛，任立世，杜昱光*

（中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190）

壳聚糖是甲壳素的部分或全脱乙酰产物，是由氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）及N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）通过β-1,4糖苷键连接而成线性聚合物[1]。壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）广泛存在于动植物及微生物中，可通过内切方式水解壳聚糖底物[2]。在糖活性酶数据库（www.cazy.org）中，已知7 个糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）家族中均包含壳聚糖酶，这些家族依次为GH-3、GH-5、GH-7、GH-8、GH-46、GH-75及GH-80。

壳聚糖的降解产物壳寡糖已被报道具有抗氧化、抗肿瘤及激活植物免疫等多种生物活性[3-6]。这些生物活性与壳寡糖的聚合度、脱乙酰度及乙酰基在寡糖链上的分布均直接相关[7]。为阐明壳寡糖结构与功能的关系及其产生活性的具体机制，极有必要制备结构确定的壳寡糖。非特异性商品酶类，如纤维素酶[8-9]、蛋白酶[10-11]及脂肪酶[12]等已被报道具有壳聚糖水解活性。然而，这些商品酶中可能同时含有多种壳聚糖水解酶类，难以获得结构确定的壳寡糖。利用表达的单一壳聚糖水解酶则可能实现特定结构类型壳寡糖的制备。

解淀粉芽孢杆菌作为一种安全的菌种，已被批准用于α-淀粉酶、β-葡聚糖酶及蛋白酶等食品用酶制剂的制备。通过基因检索发现，该菌种基因组中存在潜在的壳聚糖编码基因。目前，针对解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶的国内外研究较少，仅发现段静等[13]在大肠杆菌中对解淀粉芽孢杆菌菌株HZ-1510中的壳聚糖酶基因进行了表达及酶学性质鉴定。为获得来源于安全菌株的壳聚糖酶用于特定结构类型壳寡糖的制备，本研究利用毕赤酵母高效表达系统对来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶进行分泌表达及鉴定，进一步利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖制备结构可控的壳寡糖。本研究获得的毕赤酵母高效表达菌株具有制备工业或食品级壳聚糖酶的应用潜力，不仅如此，利用该酶水解制备的特定结构类型壳寡糖可能具有更高或者全新的生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲壳素（货号：V900332）、3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4钠盐（货号：269913） 美国Sigma-Aldrich公司；质粒提取试剂盒（货号：9760）、胶回收试剂盒（货号：9762）、T4连接酶（货号：2011A）、E. coli DH5α化学感受态细胞（货号：9057） 宝日医（北京）生物技术有限公司；毕赤酵母GS115（货号：C18100）、XhoI（货号：FD0695）、NotI（货号：FD0596）、BglII（货号：FD0084）、乙腈（色谱纯，货号：A998-4） 美国Thermo Fisher公司；蛋白Marker（货号：PR1920） 北京索莱宝科技有限公司；毕赤酵母表达载体pPIC9（货号：VT1343） 湖南科爱医疗器械有限公司；pGBG1为pPIC9信号肽核酸序列根据毕赤酵母密码子的偏好性优化后的载体[14]；毕赤酵母培养用含葡萄糖最小营养（minimal medium containing glucose，MD）培养基、含甘油缓冲复合（buffered complex medium containing glycerol，BMGY）培养基及含甲醇缓冲复合（buffered complex medium containing methanol，BMMY）培养基的配制方法参考毕赤酵母表达试剂盒说明书（货号：K1740-01） 美国Invitrogen公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Autoflex III smartbeam型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）仪、AVANCE III 600MHz核磁共振仪 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶基因全合成及表达载体构建

选择解淀粉芽孢杆菌菌株FZB42[15]中的潜在壳聚糖酶（GenBank：ABS75305.1，已去除预测的信号肽序列）的编码基因序列，使用毕赤酵母偏好的密码子进行基因序列优化，合成前在5’及3’末端分别添加XhoI及NotI酶切位点并对设计好的序列进行全基因合成（委托北京擎科新业生物技术有限公司完成）。使用XhoI及NotI分别对含有目标基因序列的pUC18及表达载体pGBG1进行双酶切，分别回收目标基因序列片段及线性化的pGBG1载体大片段，使用T4连接酶进行连接并转化至E. coli DH5α化学感受态细胞中。对构建好的含有目标基因序列的表达载体质粒进行酶切及测序（委托北京擎科新业生物技术有限公司完成）验证。

1.3.2 解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶毕赤酵母表达及初步鉴定

将获得的重组质粒经限制性内切酶BglII线性化后，凝胶电泳分离并切取含有目的基因的片段（较大片段），电击导入新制备的毕赤酵母GS115电转感受态细胞中，将通过组氨酸营养缺陷MD平板上筛选得到的重组子平铺在含有胶体壳聚糖（0.5%）的BMMY琼脂平板上进行培养，从中进一步筛选出水解圈最大的单克隆菌株。将筛选的单菌落接种于200 mL BMGY培养基中，30 ℃、250 r/min培养48 h，离心弃上清液，加入200 mL的BMMY培养基进行诱导表达。24 h后补加甲醇至其终体积分数为1%，以后每隔24 h补加一次，共计诱导120 h后离心，上清液即为含有壳聚糖酶的粗酶液。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测蛋白表达情况，Bradford法测定粗酶液中的蛋白质量浓度。以制备的脱乙酰度62%壳聚糖[14]为底物，使用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）方法测定壳聚糖的活力。在pH 3.6～8.0范围内（pH 3.6～5.6时使用50 mmol/L的乙酸钠缓冲液，pH 6.0～8.0时使用50 mmol/L的磷酸缓冲液）测定该酶的最适pH值，30～90 ℃范围内确定最佳反应温度。在40、50 ℃及60 ℃下处理壳聚糖酶1 h，每隔20 min测一次残留的酶活力。

1.3.3 低脱乙酰壳寡糖制备及组成与结构分析

使用前期制备的脱乙酰度为62%的壳聚糖[11]水解制备壳寡糖。称取50 g制备的低脱乙酰度壳聚糖，加至1 000 mL水中，加入乙酸溶解并调节至pH 6.0。再加入10 mL的粗酶液，40 ℃搅拌反应48 h。待反应结束后，升高温度至90 ℃维持10 min以灭活壳聚糖酶，离心去除不溶物后冷冻干燥用于后续分析。对酶解制备的壳寡糖进行质谱分析以初步确定其寡糖的组成：将壳寡糖配制成2 mg/mL的溶液，吸取1 μL点样至样品板上，待其自然干燥后，加入1 μL基质2,5-二羟基苯甲酸溶液，待其干燥后使用MALDI-TOF MS仪进行检测（正离子反射模式）。检测范围为300～3 000。依据一级质谱信息进行潜在壳寡糖组分组成分析的具体方法如下：先建立聚合度2～20，所有可能结构壳寡糖的H+、Na+及K+衍生物理论质荷比（m/z）数据库，将测定的m/z值与数据库中壳寡糖的理论m/z值对比，即可推测产物壳寡糖的潜在组成。本次仅标注壳寡糖的K+衍生物。

使用液体1H NMR及13C NMR分别对制备的壳寡糖的还原端及非还原端单糖组成进行分析，具体方法为：称取25 mg制备的壳寡糖冻干样品，加入0.50 mL D2O，待其充分溶解后加样检测。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4钠盐为内标，使用AVANCE III 600MHz核磁共振仪对样品进行检测，其中，1H NMR检测时对水峰进行抑制以减少其干扰。获得的原始数据使用分析软件MestReNova打开后，使用内标校正位移值后，参考Sasaki等[16]的方法对特定部位单糖进行标记，具体的参考位移值包括1H NMR中的还原端GlcN（-D，σ 5.19）、还原端GlcNAc（-A，σ 5.43）以及13C NMR中5位碳（C5）的非还原端GlcN（D-，σ 79.0）及非还原端GlcNAc（A-，σ 78.5）等。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶基因全合成、克隆及毕赤酵母表达

来源于解淀粉芽孢杆菌FZB42的潜在壳聚糖酶编码基因长度为837 bp，编码蛋白包含278 个氨基酸，在蛋白的氨基末端包含一个36 氨基酸组成的预测信号肽序列。在不改变氨基酸序列的前提下使用毕赤酵母偏好的密码子对该基因序列（不包含信号肽编码序列）进行优化，将优化后的基因序列命名为bacsn（GenBank：MG595776）。将优化前后的壳聚糖基因序列进行比对发现，共有195 个核苷酸发生了改变。将合成后的基因构建至毕赤酵母表达载体pGBG1中并使用酶切验证其正确性，电泳结果显示，含有目的基因的表达载体经XhoI及NotI双酶切后在750～1 000 bp附近出现了一个条带（E1），与目的基因（762 bp）大小相符；使用BglII对质粒线性化后出现了预期的两个片段（E2），其中，10 kb附近为含有目的基因bacsn的片段，3 kb附近为抗性基因片段（图1A）。双末端测序结果也确认目的基因被正确构建至表达载体中。将含有目的基因的表达载体bacsn-pGBG1转化至毕赤酵母GS115中并使用甲醇进行了诱导表达，对表达产物（记为BACSN）进行SDS-PAGE分析，结果显示，在35 kDa附近出现了两个蛋白条带（P1），其中，25～35 kDa之间的条带与该蛋白的预测值（28.3 kDa）相符，而大于35 kDa的条带推测为该蛋白的糖基化产物（图1B）。Bradford法测定粗酶液中的蛋白质量浓度为0.23 mg/mL。

与传统的基于活性筛选的方法相比，利用全基因合成方法可以更高效快捷地从已公开的真核及原核基因组（近20万 个）数据库中根据利用同源检索方法获得想要的基因[17-18]。结合密码子序列的优化可能进一步提高目标基因的蛋白表达水平[19]。在本研究中，对基于基因组数据挖掘获得的潜在壳聚糖酶基因进行了密码子优化并在毕赤酵母中实现了分泌表达，进一步证实该策略挖掘目标酶类的有效性。该策略的另一个优势是，可以优先选择在公认安全的物种或菌种的基因组中调取想要的酶类基因，在毕赤酵母等可用于食品酶制剂制备的系统中进行高效表达，从而使产物酶类更可能应用于食品加工等领域。

2.2 壳聚糖酶BACSN酶学性质初步鉴定

使用DNS法测定发酵上清中粗酶的活力。结果显示，该酶的最适pH值为5.0（图2A），最适反应温度为45 ℃（图2B），在上述最适反应条件下的比酶活力为52.2 U/mL。热稳定性测定结果显示，该酶在50 ℃及以下时较稳定，处理1 h后酶活力没有明显较低，当温度升高至60 ℃时，该酶很快失活（图2C）。与段静等[13]表达的来源于解淀粉芽孢杆菌菌株HZ-1510壳聚糖酶相比，最适反应温度及pH值均存在一定差异，可能与来源菌株不同的生存环境相关。上述酶学特征使BACSN具有一定工业应用前景，可能应用于壳寡糖的规模制备。一般而言，在壳聚糖水解制备壳寡糖过程中，需要首先使用乙酸、乳酸或盐酸等对其溶解，此时壳聚糖底物的pH值一般为4.0～7.0，适合BACSN发挥最佳活性；当pH值大于7.0时，壳聚糖很容易形成沉淀，影响酶类的水解效率。壳聚糖水解产物壳寡糖中暴露的氨基较活泼，在高温时容易发生褐变，因此，水解制备壳寡糖的反应温度通常在50 ℃以下，而BACSN在此温度下较稳定。

图 2 pH值（A）、温度（B）对壳聚糖酶BACSN的影响及其热稳定性（C）Fig. 2 Effects of pH value (A) and temperatures (B) on the activity of chitosanase BACSN and its thermostability (C)

2.3 壳聚糖酶BACSN水解产物组成及末端结构特征分析

使用毕赤酵母分泌表达的壳聚糖酶BACSN对前期制备的脱乙酰度62%的壳聚糖底物进行水解。MALDITOF MS检测及分析结果显示，水解物中包含聚合度3～15不同脱乙酰度的壳寡糖（图3）。与水解高脱乙酰度壳聚糖仅主要产生全脱乙酰的壳寡糖不同的是，水解低脱乙酰度底物可以获得更加复杂多样的组分，除GlcN（D）外，这些新组分中带有不同数量及分布的GlcNAc（A）单元，可能与动植物细胞的特定受体或结合蛋白，如植物的几丁质受体[20-23]、动物的甘露糖受体[24-25]及几丁质酶样结合蛋白YKL39[26]和YKL40[27]等结合发挥生物活性。不仅如此，酶法水解低脱乙酰度壳聚糖底物时，因GlcNAc的存在，酶的水解位点相对减少，可以获得更高聚合度的壳寡糖，而充分酶解高脱乙酰度壳聚糖时，便很难得到聚合度高于6的壳寡糖。有研究发现，只有聚合度大于6的几丁寡糖或者几丁质才能与其植物受体AtCERK1结合并促进其形成二聚或寡聚体而产生免疫激活活性[28]。部分脱乙酰的复杂壳寡糖可能也与这些专一性识别GlcNAc单元的受体结合，因该类型壳寡糖乙酰化的糖单元含量更少，聚合度要求可能更高。Einarsson等[29]在研究人骨关节炎软骨细胞表面的受体YKL-40与几丁寡糖及部分脱乙酰壳寡糖的结合能力时发现，几丁六糖（A6）与该受体亲和力较强，部分脱乙酰壳寡糖D2A4及D3A3也可与该受体结合，但亲和力较弱；使用较高聚合度的低脱乙酰度壳寡糖D5A6时发现，其与受体的亲和力与几丁六糖相当。上述研究结果也提示，低脱乙酰壳寡糖因其含有乙酰化单糖单元且聚合度较高，可能与特定动植物受体结合发挥先天免疫激活等生物活性。与较高聚合度的几丁寡糖相比，低脱乙酰度壳寡糖可以通过酶法规模化制备且特定活性可能比传统壳寡糖更高，因而具有更广阔的应用前景。

图 3 酶解产物MALDI-TOF MS分析Fig. 3 MALDI-TOF MS spectrum of hydrolysate

进一步使用液体1H NMR及13C NMR对酶解产物壳寡糖的还原及非还原末端结构特征进行鉴定，结果显示，还原末端及非还原末端均主要由GlcN（D）组成，说明该酶主要水解GlcN-GlcN糖苷键（图4）。根据壳聚糖酶对部分脱乙酰壳聚糖水解位点的差异，可将其分为3 个亚类：I类可同时水解糖苷键GlcN-GlcN及GlcNAc-GlcN，II类仅能水解糖苷键GlcN-GlcN，而III类可同时水解水解糖苷键GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc[2]。因此，推测BACSN属于I类壳聚糖酶，这也与MALDI-TOF MS的数据较好的对应：因水解仅发生于GlcN-GlcN，产生的寡糖两端至少均带有一个GlcN，因此，所有的壳寡糖均应含有至少两个GlcN，质谱的分析结果中所有壳寡糖均符合该要求。酶解产物的两端不应该存在GlcNAc组分，但NMR的分析结果显示，这些组分仍然在末端少量存在，推测可能是在弱酸（pH 6.0）及较高温度（40 ℃）反应条件下，同时发生了一定程度的酸降解。

制备较高聚合度低脱乙酰度壳寡糖是该领域研发的新方向。使用化学法将传统壳寡糖重新乙酰化也可以获得低脱乙酰度壳寡糖，但聚合度仍然较低，且难以实现规模制备。以低脱乙酰度壳聚糖为底物，使用具有壳聚糖水解活性的酶类，如壳聚糖酶、几丁质酶及非特异性商品酶等，利用其差异的底物识别特性，可以制备不同末端结构特征的壳寡糖。理论上，通过底物脱乙酰度的控制，结合特定酶的水解，可实现产物聚合度的调控。因此，基于上述策略，可实现壳寡糖聚合度、脱乙酰度及乙酰基位点等结构特征的调控。已在前期利用几丁质酶水解制备了特定结构特征的低脱乙酰度壳寡糖[30]，后期将对本研究及前期制备的不同结构特征壳寡糖组分的活性进行评价。

图 4 酶解产物1H NMR（A）及13C NMR（B）分析Fig. 4 1H-NMR (A) and 13C NMR (B) spectra of hydrolysis products

3 结 论

本研究利用全基因合成方法合成并在毕赤酵母中分泌表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶并对其酶学性质进行鉴定。同时，利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖制备低脱乙酰度壳寡糖并对其组成及结构特征进行鉴定，结果显示，酶解产物中含有聚合度3～15不同脱乙酰度的壳寡糖，且还原及非还原端均主要由GlcN单元构成。与传统壳寡糖相比，BACSN水解低脱乙酰度壳聚糖制备的新型壳寡糖具有更复杂的组成且具有特定的结构特征，可能具有更高或者新的生物活性。后续将对这些组分进行分离并对其生物活性进行更深入研究。