L-阿拉伯糖与氨基酸美拉德反应挥发性风味物质分析

冯 涛，赵 宇，张治文，庄海宁，宋诗清，姚凌云，孙 敏，徐志民

（1.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403；3.美国路易斯安那州立大学食品科学系，美国 路易斯安那 巴吞鲁日 70802）

美拉德反应由法国著名化学家Maillard L C于1912年发现并命名[1]，是广泛存在于食品工业的一种非酶褐变，又称为“非酶棕色化反应”。该反应是羰基化合物和氨基化合物经过复杂的历程最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素，故又称其为羰氨反应[2-3]。

L-阿拉伯糖是一种低热量甜味剂，可抑制肠道内蔗糖酶的活性，减少蔗糖吸收，有效减少体内糖含量[4]。此外，L-阿拉伯糖还可抑制脂肪堆积，用于防治肥胖、高血压、高血脂等疾病[5-6]。日本厚生省将L-阿拉伯糖列入“调节血糖的专用特殊保健食品添加剂”；美国医疗协会将L-阿拉伯糖列入“抗肥胖的营养补充剂或非处方药”；2008年我国卫生部正式批准L-阿拉伯糖为新资源食品，确认其在功能糖领域的重要地位[7]。

近年来研究发现L-阿拉伯糖的反应型香精香气柔和、丰富，赋予使用香精终端产品以更接近自然和饱满的香气，许多国际香精公司开始研究使用L-阿拉伯糖生产反应型香精，如美国Danisco公司已有L-阿拉伯糖CT98和L-阿拉伯糖糖浆2 种产品作为反应型香精的生产原料供应国际市场。为提高饮食健康，减少肥胖、高血压等疾病的干扰，采用L-阿拉伯糖为原料生产反应型甜味香精将成为一种新的健康饮食方式。

通常以葡萄糖、果糖、木糖等还原糖作为美拉德反应原料制备风味物质，而用L-阿拉伯糖作为美拉德反应原料制备风味物质的实验却鲜有涉及。如周向军等[8]则以甘氨酸-果糖、精氨酸-果糖为原料制备美拉德反应产物。周志磊等[9]用葡萄糖、果糖与脯氨酸发生美拉德反应，产生具有焦甜香的风味化合物，如2-乙酰呋喃、菠萝酮和5-乙基麦芽酚。Wong等[10]研究酸性条件下葡萄糖与17 种氨基酸美拉德反应的呈味情况，研究发现甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸和缬氨酸与葡萄糖反应可产生焦甜香；脯氨酸产生花香；丙氨酸产生水果香和花香；丝氨酸产生水果香等。

本实验在先前研究[11]的基础上，采用L-阿拉伯糖与丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸在不同条件下发生美拉德反应生成反应型甜味香精，并分析比较其风味特征，为开发以L-阿拉伯糖为原料的甜味香精提供思路、借鉴和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-阿拉伯糖（食品级） 济南圣泉唐和唐生物科技有限公司；丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸（食品级）河南润诚食品配料有限公司；2-辛醇（内标，色谱级标准品） 德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；正构烷烃（C7～C30）、2,5-二甲基吡嗪、2,6二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5甲基吡嗪（色谱级标准品） 美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ML104电子分析天平、FiveEsay Plus pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HHS-11-2数显恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）头 上海安谱实验科技股份有限公司；HP-INNOWAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890 GC-5973C MS气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪 安捷伦科技有限公司；DF-101S热恒温油浴锅 上海乔跃电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反应产物的制备

按分组比例准确称取L-阿拉伯糖与甘氨酸共2 g后倒入三口烧瓶中，然后向锥形瓶中添加20% 1,2-丙二醇溶液23 mL后振荡摇匀并加热制备美拉德反应香精。第1组：L-阿拉伯糖与丙氨酸美拉德反应条件[11-14]：pH 9.42，温度80 ℃，L-阿拉伯糖∶丙氨酸0.3∶1，反应时间86 min；第2组：L-阿拉伯糖与甘氨酸美拉德反应条件：pH 9.13，温度81 ℃，L-阿拉伯糖∶甘氨酸3∶1，反应时间53 min；第3组：L-阿拉伯糖与苏氨酸美拉德反应条件：pH 9.26，温度80 ℃，L-阿拉伯糖∶苏氨酸0.33∶1，反应时间50 min；第4组：L-阿拉伯糖与丝氨酸美拉德反应条件：pH 8.13，温度81 ℃，L-阿拉伯糖∶丝氨酸0.90∶1，反应时间51 min。

1.3.2 香气物质SPME与GC-MS检测

用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头对挥发性和半挥发性成分进行SPME。在15 mL顶空瓶中加入7 mL反应香精，5 μL 2-辛醇，插入萃取头，60 ℃平衡15 min后萃取30 min，250 ℃ GC解吸5 min，进行GC-MS分析[15-16]。

毛细管色谱柱型号：Agilent HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；采用不分流进样模式；载气为氦气，流速1.0 mL/min；电子电离源，电子能量70 eV；离子源温度250 ℃，质谱接口温度250 ℃，扫描范围m/z 30～450[17-18]。

升温程序：进样口250 ℃，柱初温40 ℃，保留6 min，以8 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，保留20 min。

1.3.3 香气物质的定性与定量

定性：通过检出物质谱图和NIST 05a.l、Wiley 7n.l数据库（美国Agilent公司）中标准谱图的比对；通过与标准品保留时间对比；与标准品的保留指数（retention index，RI）进行比对，没有标准品的，与已报道文献中RI进行比对。RI根据计算得到，按照样品分析方法，取0.2 μL正构烷烃（C7～C30）混标注入GC-MS，通过烷烃混标的保留时间与样品中挥发性成分的保留时间计算未知化合物的RI，计算见式（1）：

式中：RIX为未知化合物X的RI；tX为未知化合物X的保留时间；tZ、tZ+1为未知化合物相邻前后的2 个正构烷烃的保留时间；Z为未知化合物X出现之前的正构烷烃的碳原子数。

定量：对于香气活性值（odor activity value，OAV）大于1的物质，采用内标标准曲线法进行定量。以预测组分标准品与内标物的响应值之比为纵坐标、标准溶液质量浓度为横坐标，得到内标标准工作曲线。通过标准曲线计算预测组分含量[19]。采用内标法对反应香精中的香气化合物进行定量，按照公式（2）进行计算：

式中：CX为未知化合物X质量浓度/（μg/L）；f为校正因子（将校正因子设为1）；CO为内标2-辛醇质量浓度/（μg/L）；AX、AO分别为未知化合物X的峰面积和内标2-辛醇的峰面积。1.3.4 感官评价

参照食品感官评价原理与技术[20-22]，由8 名接受过专业感官培训的成员组成感官评价小组，年龄均在23～28 岁之间。将需嗅闻的产品进行随机编码，并水浴加热至30 ℃后进行嗅觉感官评价（烤香、青香、花果香、可可香）。采用10 分评分制，最后得分为各香气得分平均值。

1.3.5 OAV计算

OAV定义为香气化合物的含量与其在水中阈值的比值[23]，根据公式（3）[24]计算：

式中：F为样品中香气化合物质量浓度；T为香气化合物的阈值。

1.4 数据处理

使用SPSS 20.0进行主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA相关数据进行中心化与标准化（1/Sdev）处理，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 挥发性风味化合物分析结果

由表1可知，L-阿拉伯糖分别与丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸发生美拉德反应产生可可、烤香的风味。风味化合物为2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪。其中尤为突出的风味化合物为2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪。L-阿拉伯糖分别与苏氨酸、丝氨酸发生美拉德反应产生带有青香风味的化合物薄荷酮。L-阿拉伯糖与丙氨酸发生美拉德反应产生带有花果香的风味化合物5-茚醇。

表 1 反应香精挥发性成分GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis of volatile components of Maillard reaction products (MRPs)

2.2 感官评价分析

表 2 各香气感官评价结果Table 2 Sensory scores for intensity of aromas of MRPs

由表2可知，L-阿拉伯糖分别与丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸发生美拉德反应均产生强烈的烤香和可可香。L-阿拉伯糖分别与苏氨酸、丝氨酸发生美拉德反应产生中等强度的青香，相比之下L-阿拉伯糖分别与丙氨酸、甘氨酸反应产生的青香较弱。L-阿拉伯糖与丙氨酸发生美拉德反应产生中等强度的花果香。

2.3 关键挥发性风味化合物鉴定结果

若仅通过挥发性风味化合物含量确定香气的贡献度，并不能准确反映其对于美拉德反应产物香气的贡献程度，故而采用OAV讨论美拉德反应产物中关键的挥发性风味物质。OAV＞1，香气贡献明显，OAV越大则贡献程度越大。OAV＜1，该风味物质不是关键风味物质，在产物中起协香作用。

对GC-MS检测结果计算OAV，结果如表3所示（可查询阈值物质），其中有7 种物质OAV大于1，这些物质被认为是美拉德反应产物的关键组分。其中6 种物质为吡嗪类物质，主要的风味特征为烤香和可可香。这与感官评价所得结果相似，感官评价中主要的感官属性为烤香和可可香。由表3可知，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪OAV较大，故为美拉德反应产物中最关键的风味物质。

在检测到的风味化合物中薄荷酮具有特有的青香风味，虽不是关键性风味物质，但仍能在反应产物中嗅闻到青香的风味。L-阿拉伯糖和苏氨酸的美拉德反应产物中可嗅闻到淡淡的青香风味，但其他反应产物中青香味不明显。

表 3 反应香精中挥发性物质的OAVTable 3 OAV of volatile components of MRPs

2.4 挥发性化合物PCA

如图1所示，在第1象限中，与B4（可可香）相关的风味化合物为C9（2-乙基-6-甲基吡嗪）、C11（2,3,5-三甲基吡嗪）、C12（3-乙基-2,5-二甲基吡嗪）。由此可知C9、C11、C12主要贡献可可风味。在第2象限中，与S3（L-阿拉伯糖与苏氨酸美拉德反应产物）相关的感官属性为B2（青香），相关的风味化合物为C15（薄荷酮）。第4象限中，与S1（L-阿拉伯糖与丙氨酸美拉德反应产物）相关感官属性为B1（烤香）和B3（花果香），相关的风味化合物为C1（丙酮）、C4（2-甲基吡嗪）、C5（2,5-二甲基吡嗪）、C7（2-乙基吡嗪）、C10（2-乙基-5-甲基吡嗪）、C13（2-乙基-3,5-二甲基吡嗪）、C14（2-乙酰基吡啶）。其中C4、C5、C7、C10、C13主要贡献烤香的风味，C1主要贡献花果香。

图 1 16 种挥发性风味化合物PCAFig. 1 PCA plot for 16 volatile flavor compounds

综合图1可知，产生烤香风味的C4、C5、C7、C10、C13与S1相关性较高。而由2.1节可知S2、S3、S4中也含有C4、C5、C10且含量较大，但低于S1中含量。综合考虑可知S1产生的烤香最为浓厚，此结果与感官评价结果相同。产生花果香的5-茚醇仅存在于S1中，故S1中有花果香。产生青香的C15在S3中含量较高，且C15与S3相关性较高，故S3中青香味较其他物质中青香味大。

3 结论与讨论

由于美拉德反应受pH值影响较大，尤其在pH值大于9的情况下会产生大量吡嗪类物质[26-28]。在L-阿拉伯糖与4 种氨基酸反应的美拉德产物中，产生的2,5-二甲基吡嗪含量最多，其为美拉德反应常见生成产物[29-32]。

L-阿拉伯糖与丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸发生美拉德反应均可产生强烈的烤香、可可香风味物质，如2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪，且风味贡献度较高，适用于添加到可可、咖啡、巧克力中。L-阿拉伯糖与苏氨酸发生美拉德反应产生带有淡淡的青香风味物质薄荷酮，适用于添加到饮料、香烟和糖果中。L-阿拉伯糖与丙氨酸发生美拉德反应产生带有微弱的花果香风味物质5-茚醇、丙酮。本实验探究L-阿拉伯糖分别与丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸发生美拉德反应生成的甜味香精挥发性风味化合物，并分析比较风味特征及对其主要风味物质的反应机理进行探讨，为今后甜味香精的开发提供新的方向。