便携式葡萄专用可见-近红外光谱检测仪器开发与实验

肖 慧，孙 柯，屠 康，潘磊庆*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

果蔬品质安全检测主要包括对果蔬外部品质、内部品质及食用安全性的测定及评估，其中果蔬的内部品质检测是果蔬流通中的重要环节之一[1]。传统的果蔬内部品质检测方法主要是抽样进行破坏性实验，检测成本高，而且测量每种参数都需要进行不同的实验，不能够满足果蔬快速分级分选及品质指标预测的现实要求。同时，传统的品质检测方法无法完成多指标同时检测，耗时耗力[2-4]。现如今，越来越多的无损检测技术被应用于果蔬的品质检测中，其中，近红外光谱技术备受关注。近红外光谱的光谱区域范围为800～2 500 nm，该谱区承载的分析信息主要是分子含氢基团振动的倍频和合频，因此可充分利用全谱或多波长下的光谱数据进行定性或定量分析[5]。现代近红外光谱分析是光谱测量技术、计算机技术、化学计量学技术与基础测试技术的有机结合，通过将近红外光谱所反映样品基团、组成或物态信息与用标准或认可的参比方法测得的组成或性质数据采用化学计量学技术建立校正模型，然后通过对未知样品光谱的测定和建立的校正模型完成快速预测其组成或性质的一种分析方法[6]。

近年来，近红外检测技术作为一种无损、快速分析和评估各类食品质量与安全的方法，得到了广泛认可。近红外光谱技术发展迅速，微型化的光谱仪已成为快速分析研究的重点，因其具备体积小、重量轻、价格低和高性能等特点，为现代食品、药品、日用品等领域的快速检测提供了有力的支撑[7]。同时因近几年光谱技术的迅猛发展，实现该技术的硬件更为多样，使得设计开发不同用途的近红外仪器更易于实现，其中针对不同样品的专用检测设备成为现今近红外应用的热点，是将近红外研究由理论转为应用的关键一步，对于促进近红外技术的发展有极其重要的作用。郭志明等[8]基于新型光谱仪微机电系统开发了果蔬品质手持式近红外设备，能完成对番茄中可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）及番茄红素的预测。冯帮等[9]利用线性渐变滤光片作为分光原理开发了小型近红外检测系统。闻明等[10]研制了以发光二极管为近红外光源的整粒小麦成分快速分析仪器。王凡等[11]基于可见-近红外光谱技术开发的便携式番茄多品质检测装置可对番茄的颜色、硬度、总酸、总糖实现快速无损的同时检测。李倩倩等[12]利用自搭建的猕猴桃SSC便携式无损检测系统对多个品种的猕猴桃糖度进行了预测。尹慧敏等[13]设计开发的便携式谷物成分近红外检测仪对水稻的测试实验中得到蛋白质的预测与真实值相关系数为0.747 1，其结果进一步证明了便携式食品近红外检测仪的可行性。

葡萄的采后处理、品质鉴定检测一直是农产品加工研究的重要课题，采用近红外光谱技术建立的葡萄品质预测模型良好，Fernanez-Novales等[14]利用光纤型近红外光谱仪研究白葡萄酒发酵液中的干物质及糖分变化，Nogales-Bueno等[15]利用近红外光谱确定葡萄的成熟度，Hernandez-Hierro等[16]基于近红外光谱信息研究葡萄成熟过程总的花青素变化，Urraca等[17]利用手持式近红外设备对田间整穗葡萄的糖度检测实验，结果表明便携式近红外设备对田间葡萄穗品质检测的可行性。本实验主要研究基于光纤可见-近红外技术的低成本、小型葡萄专用品质预测仪器的开发，并选用“美人指”和“白玉霓”两个品种对仪器进行验证实验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

图 1 “美人指”葡萄（A）及“白玉霓”葡萄（B）Fig. 1 Manicure Finger (A) and Ugni Blanc (B)

“美人指”葡萄（Vitis vinifera L. cv. Manicure Finger）和白色的“白玉霓”葡萄（Vitis vinifera L. cv.Ugni Blanc）（如图1所示，采集不同成熟期的每种葡萄各200 粒），采自江苏南京八卦洲（32°5′N，118°8′E，南京）。

图 2 葡萄品质可见-近红外检测仪器Fig. 2 Vis-NIR instrument for examining grape quality

图 3 工作流程图Fig. 3 Flow chart of the working process

没食子酸标准品、HCl、乙醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PAL-1手持糖度仪 日本爱拓公司；Ci6X手持色差仪美国爱色丽公司；UV 1800紫外分光光度计 日本岛津公司；FX2000型光谱仪、FIB-Y-200-NIR光纤、HL2000光源、STD-WS校正白板 上海复享公司；Surface Pro3平板电脑 美国微软公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄品质近红外快速检测系统硬件

1.3.1.1 葡萄品质近红外快速检测系统工作原理

本研究设计的葡萄品质可见-近红外检测仪器，采用漫反射模式获取整粒葡萄浆果的可见-近红外光谱（400～1 100 nm），光纤传输将携带葡萄品质信息的光信号输入光谱仪后经数据采集卡，进行模数转换（A/D）后传输到平板电脑，最后在平板电脑上完成光谱的还原及数据处理。仪器硬件部分主要包括：光源、光纤光谱仪、传输光纤、样品池、掌上电脑和壳体，如图2所示。仪器工作流程如图3所示。

1.3.1.2 光谱采集模块

市售的光谱仪根据分光系统的不同大致可分为傅里叶变换型、声光可调滤光型、滤光片型、光栅型4 大类。分光系统的性能决定近红外光谱仪包括光谱分辨率、波长准确性和波长重复性在内的多个核心参数[18]。波长范围是选择光谱仪的重要参考衡量指标之一，而波长范围的选择因测试样品种类、状态、需预测的指标的不同而不同，对于葡萄而言，Beghi等[19]曾利用可见-近红外光谱对葡萄的植物检疫状态进行预测评估，Martinez-Sandoval等[20]使用近红外高光谱对单粒葡萄果粒的花青素含量进行建模预测。Kemps等[21]利用可见-近红外光谱对多个葡萄品种中包含花青素、多酚含量、总糖含量及硬度在内的多个指标进行建模预测，在本仪器中，考虑成本、稳定性、建模可靠性等多个因素后，选择400～1 100 nm作为指标检测的建模波段。

微型光纤光谱仪一般采用衍射光栅作为分光系统，影响分光效果的主要因素是光栅的角色散和线色散参数，光栅的色散越大，分光效果越好。为提高光谱仪的光学特性，很多光谱仪采用非对称交叉式Czemy-Turner结构，但该结构较为复杂，且依然存在杂散光水平较高的问题[22]。本系统选用微型光纤光谱仪作为系统的核心器件，新型全息凹面光栅使用了非等距分布的的凹槽，没有鬼线，杂散光很低，使光栅分光系统的光学性能有较大提升，同时降低了系统复杂度，具备光路简洁、体积小、便于安装等优点[23]。

该光谱仪的原理是光源发出的光先经过样品池，再由光栅分光，光栅不需转动，经光栅色散的光聚焦在多通道检测器的焦面上，同时被检测。在可见-短波近红外区域使用电荷耦合器件作为检测器，通道数达2 048 个，可获得很好的分辨率。由于检测器对所有波长的单色光同时检测，扫描速率大大提升，在1 s内可完成上百次的扫描累加，从而得到较高的信噪比和灵敏度。

1.3.1.3 光源及光传输模块

光源的发光范围决定了光谱仪的工作波长范围，对近红外仪器中的光源系统的基本要求是能在测量谱区内保证足够的光强和稳定性，以保证光谱的稳定性。本系统采用卤素灯，卤素灯光源同时包含可见光区域和近红外光区域，能满足可见-近红外光谱仪的需求，同时性能稳定。

本系统中的光传输通过低OH的Y型石英光纤传导，适合于漫反射模式，光纤利用全反射的原理把光约束在其界面内，并引导光波沿着光轴线的方向前进[24]。Y型光纤双头端的一头连接光源，将光源发出的光传输至单头端，光从单头端发出照射到样品后与样品作用，漫反射的光被单头端接收传输至双头端的另一头进入光谱仪被分析。

1.3.1.4 样品池模块

考虑到检测对象为单粒葡萄浆果，检测光纤头与葡萄浆果表面的距离直接影响样本光谱的可靠性。实验发现，光纤头贴近样本表面的测量方式能最大程度降低照射光斑不一样带来的实验误差。由于不同品种的葡萄果粒之间存在形状和大小的差异，为满足不同品种葡萄的测定需求，本系统设计了可调式支撑模块，用于调整不同大小的样品表面至光纤检测端的距离，保持光斑大小一致，如图4所示。通过调节带有内螺纹的样品架控制样品表面距离光纤端口的距离，极大地减小了由于光斑大小不一致带来的实验误差。

图 4 葡萄测定专用样品池Fig. 4 Designed sample cuvette for grape berries

1.3.2 便携式葡萄多品质无损检测仪器软件开发

软件系统包括：黑白背景校正、干涉图数据采集、光谱显示、数据分析处理、数据保存及管理四大功能模块。软件基于Windows系统采用C#撰写，通过USB通讯功能控制光谱仪完成对样品光谱的采集，采集到的干涉图经过计算机处理后可还原为光谱数据并进行计算分析。将自动将背景光谱设定为0%，白板光谱设定为100%，待背景光谱及白板光谱采集完成后才可进行样品光谱的采集，采集到的光谱数据与背景光谱及白板光谱进行计算后，软件界面会显示光谱反射率数据图像。

在数据采集模块中，用户可根据不同的葡萄品种设定不同的积分时间参数及平滑窗口数，实现仪器利用的最大化。光谱模型采用最小二乘-支持向量机（least squares support vector machine，LS-SVM）回归建立，相较于常规的偏最小二乘回归[25]能提供更好的预测结果，更小的预测偏差。通过该系统测得的光谱数据可批量以.txt格式保存，此设计更便于日后的模型更新及完善。

1.3.3 光谱数据的采集

利用可见-近红外系统完成对所有果粒样本可见-近红外光谱的采集，光源强度为9 W，光谱波段为400～1 100 nm，积分时间为4 ms，采样平均次数为10 次，光谱分辨率为0.38 nm。以每个葡萄果粒赤道上间隔180°的两个点作为采样点，这两点的光谱作为独立数据预测CIE L*a*b*值，这两点的光谱平均值作为该样品的光谱值预测SSC及总酚（total phenolic，TP）含量。

1.3.4 理化指标的测定

SSC：通过手持糖度仪测定，精确度为0.1 °Brix；L*、a*、b*：通过手持色差仪测定，L*值代表明度，a*值表示红绿值，b*值表示黄蓝值；TP含量：通过Fragoso等[26]所述方法测定。将葡萄皮用液氮冷冻研磨，取0.2 g研磨后果皮样品于20 mL乙醇酸溶液（1% HCl-96%乙醇（17∶3，V/V）中40 ℃超声浸提40 min。浸提后溶液于13 710×g离心5 min，上清液用乙醇酸溶液定容至50 mL，用紫外分光光度计在280 nm波长处测定吸光度。用2.0～20.0 mg/L的没食子酸标准溶液作标准曲线，TP含量数据表示为每千克鲜样中的没食子酸质量（g/kg）。

1.3.5 仪器稳定性测试

为测试本仪器的稳定性，选取3 个葡萄样本，每个样本75 min内每15 min测定一次光谱X（每个样本共测定6 次），按下式计算每个样本的光谱值平均相对误差百分比：

2 结果与分析

2.1 稳定性测试结果

3 个样本的平均相对误差百分比的平均值如图5所示，同一样本在75 min内多次测定的平均相对误差在400～1 100 nm内均不超过10%，证明了仪器中包括光源、光谱仪在内的硬件的稳定性和重复性。

图 5 3 个葡萄样品75 min内每15 min测定的光谱平均相对误差Fig. 5 Mean relative spectral errors of three grape samples measured for every 15 minutes in 75 minutes

2.2 两种葡萄品质最小二乘-支持向量机回归建模结果

每个样品的原始近红外光谱共2 048 个波长数据点（覆盖波长范围为347.29～1 131.22 nm），由于前后段噪声较大，在建模及预测分析中去除了前141及最后的80 个波长数据点保留了400.29～1 100.05 nm共1 827 个波长的数据进行后续分析。利用标准正态变换和平均窗口平滑降低系统噪声及散射造成的干扰[27]。预处理后的光谱数据利用基于径向基核函数的LS-SVM建立模型，通过留一交叉验证的最小预报误差平方加和确定模型的最佳参数γ和α的值[28]。模型的结果如表1所示。

表 1 2 种葡萄品质LS-SVM回归建模结果Table 1 LS-SVM regressions for grape quality parameters

本系统能对“美人指”葡萄及“白玉霓”葡萄的a*值、SSC及TP含量有较好的建模效果，建模集的R2均高于0.90；交叉验证的R2cv略低于相应模型的建模集决定系数Rc2，交互验证均方根误差（root mean square error of cross-validation，RMSECV）略高于相应模型的交互验证均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC），但结果相差不大，证明模型没有过拟合，同时证明系统中选用LS-SVM作为建模模型的可靠性，且因子数越少时，模型计速度越快。由于成熟的“美人指”葡萄呈红色的手指状长条形，成熟的“白玉霓”葡萄呈黄色的圆球形，证明该系统的硬件选择及样品池的设计能够满足不同形状大小的葡萄的需要。“美人指”葡萄品种a*值、SSC及TP含量LS-SVM模型的RMSEC分别为2.16、0.84 °Brix、0.19 g/kg，能够满足实际应用要求。

2.3 两种葡萄模型预测结果

从江苏南京八卦洲采集“美人指”及“白玉霓”两个品种的葡萄浆果各70 粒，对装置进行外部验证。通过仪器获得每个葡萄浆果的光谱值，并调用仪器内置模型预测出该样本的理化参数值，同时与理化方法测得的参考值进行比较，结果如表2及表3所示。

表 2 2 种葡萄模型预测结果Table 2 Model prediction of grape quality parameters

表 3 验证集的理化测定值及模型预测误差Table 3 Reference values and prediction errors of prediction set for each parameter

外部验证的预测集结果显示，两个品种的各品质指标能够被较好的预测，其中，“美人指”的a*值、SSC、TP含量3 个指标的预测决定系数（R2p）分别为0.81、0.85、0.85，预测根均方误差（root mean square error of prediction，RMSEP）分别为3.15、1.39 °Brix、0.24 g/kg；“白玉霓”3 个指标的R2p分别为0.83、0.90、0.83，RMSEP分别为0.78、1.56 °Brix、0.22 g/kg。Cozzolino[29]、Ferrer-Gallego[30]等曾提出当预测集标准差均方根误差的比值（the ratio of standard deviation to standard error of prediction set，RPD）低于1.4时，模型不可靠；当RPD值在1.4～2之间时，模型相对可靠；当RPD高于2时，证明该模型可被认为是一个较好的模型。如表2所示，所有模型的RPD值均高于1.4，两个葡萄品种的a*值、SSC、TP含量3 个指标均能被很好地预测，模型RPD均高于2，其中“白玉霓”的SSC模型的RPD高达3.07。同时，统计结果显示（表3），对于L*、a*、b*的预测，“美人指”品种的最小预测误差为0.14，“白玉霓”品种的最小预测误差为0.00；对于SSC的预测，“美人指”品种的最小预测误差为0.03 °Brix，“白玉霓”品种的最小预测误差为0.04 °Brix；对于TP的预测，“美人指”品种的最小预测误差为0.00 g/kg，“白玉霓”品种的最小预测误差为0.00 g/kg。外部验证结果证明本仪器可满足不同类型葡萄果粒的品质检测需求。

3 结 论

本研究开发的葡萄专用小型近红外检测仪器能够满足多种类型葡萄果粒的测定需求，对于不同种类的葡萄能够根据实际情况选择合适的测定参数，同时软件数据存储的设计能够更便于日后模型更新的需求，充分展现一机多用。对于2 个不同品种葡萄实验表明本系统能够对葡萄的表面颜色、SSC、TP含量完成较好的建模效果，外部验证结果显示模型对 “美人指”a*值、SSC、TP含量3 个指标的RMSEP分别为3.15、1.39 °Brix、0.24 g/kg；模型对“白玉霓”3 个指标的RMSEP分别为0.78、1.56 °Brix、0.22 g/kg。本研究为果蔬专用型近红外仪器的开发提供了方法参考。