微生物发酵法制备高纯度水苏糖的研究

舒丹阳，谢瑾，崔春

(华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

草石蚕(StachyssieboldiiMiq.)又名螺丝菜、宝塔菜，属于唇形科水苏属中能形成地下块茎的栽培种，是一种野生植物资源[1,2]。草石蚕的主要活性成分为水苏糖，其中水苏糖含量高达12%～15%[3]。水苏糖是天然存在的非还原性功能性低聚糖，具有增殖肠道益生菌、抑制腐败菌生长，促进肠道蠕动的作用[4]，功能性低聚糖还能增强机体的免疫力，保护肝功能[5]。水苏糖粘度高，羟基较多，持水能力强，可用作药物赋形剂，也适用于冲剂、胶囊剂、片剂、口服液等剂型的医药品[6]。从天然原料中直接提取生产的水苏糖产品纯度较低，“杂糖”的存在降低了水苏糖的功能特性，限制了它的使用。因此，开发一种制备高纯水苏糖的新技术对于开拓水苏糖的应用领域具有重要意义。本研究以草石蚕为原料，通过高温提取获得糖液，并以水苏糖保留率和蔗糖降解率为指标，筛选出最佳的单菌发酵菌株；根据单菌对果糖、葡萄糖、蔗糖、水苏糖等的利用规律，进行混菌发酵，分析、优化混菌发酵工艺。本文旨在建立一条生产高纯水苏糖的工艺路线，为高纯度水苏糖的大规模生产提供了理论及实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干基草石蚕鲜品：采购于甘肃镇原，清洗晒干后贮藏于干燥器中备用。干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)：由华南理工大学食品蛋白质实验中心提供；米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)沪酿3.042：石家庄市鼎鑫酿造食品科学研究所；黑曲霉曲精(Aspergillusniger)：济宁玉园生物科技有限公司。

水苏糖标品(≥98.0%)：购自美国Sigma公司；棉籽糖 (≥98.0%)：购自阿拉丁试剂公司；甘露三糖、蔗糖、葡萄糖、果糖：购自上海博奥生物技术有限公司；水苏糖样品(纯度75.0%)：购自西安浩天生物工程有限公司；其他试剂：均为分析纯。

1.2 实验仪器

Waters系列高效液相色谱仪、2414-示差检测器 美国Waters公司；Agilent-ZORBAX NH2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 美国安捷伦科技有限公司；HH-8数显电子恒温水浴锅 江苏省金坛市宏华仪器厂；EL3002电子天平、AL204分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SXZ超净工作台 上海浦东跃新科学仪器厂；SCIENTZ-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；ZJP-A1430型霉菌培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；GL-21M 高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵纯化工艺流程

干基草石蚕→复水处理→过滤取上清→单菌发酵筛选→混菌发酵优化→精制纯化→冷冻干燥。

取50 g干燥的草石蚕放入锥形瓶中，按一定的料液比加入去离子水，在常温下分别静置一定时间，在102 ℃下提取80 min。所得草石蚕提取液冷冻干燥后，测总糖含量和水苏糖含量。

水溶性总糖的测定：采用苯酚-硫酸法[7]。

水苏糖含量的测定：采用高效液相色谱法[8]，参照GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定 高效液相色谱法》，略作修改。

1.3.2 单菌发酵筛选

米曲霉、黑曲霉的发酵培养：取100 mL提取液于250 mL锥形瓶中，密封，于121 ℃灭菌20 min，冷却后分别加入0.01%的曲精，培养温度30 ℃，分别于12，24，36，48 h取样，所得样品均在95 ℃沸水浴中加热15 min灭霉，最后对样品进行糖分分析。

3种乳杆菌的发酵培养：取0.1 mL活化的菌液于100 mL灭菌过的草石蚕提取液中，30 ℃下间歇震荡培养，分别于12，24，36，48 h取样，在95 ℃沸水浴中加热15 min灭菌，最后对不同发酵时间的发酵液进行糖分分析。

1.3.3 混菌发酵培养优化

黑曲霉和干酪乳杆菌的发酵培养：草石蚕经高温提取后，放置冷却，按接种量0.01%或0.02%分别加入黑曲霉曲精和干酪乳杆菌种子液，同时加入0.05%蔗糖酶抑制剂EDTA。培养温度30 ℃，分别于12，24，36，48 h取样，所得样品均在95 ℃沸水浴中加热15 min进行灭菌，最后对样品进行糖分分析。

2 结果与讨论

2.1 5种菌株不同发酵时间对提取液中水苏糖、蔗糖、其他杂糖含量的影响

图1 5种菌株发酵不同时间对水苏糖和蔗糖浓度的影响Fig.1 Effects of fermentation time of five strains on the concentration of stachyose and sucrose

图2 5种菌株发酵不同时间对杂糖浓度的影响Fig.2 Effects of fermentation time of five strains on the concentration of heterosaccharide

注：A为黑曲霉发酵；B为米曲霉发酵；C为干酪乳杆菌发酵； D为瑞士乳杆菌发酵；E为鼠李糖乳杆菌发酵。

由图1和图2可知，黑曲霉发酵24 h后，水苏糖少部分降解生成甘露三糖，大部分蔗糖发生降解，水苏糖的保留率为97.34%，蔗糖的降解率为45.06%。在发酵36 h后，水苏糖的降解率增加，水苏糖的保留率降为91.23%，同时蔗糖也被进一步降解消耗，降解率增加到65.59%。在发酵48 h后，蔗糖的降解率增加到69.44%，而水苏糖的保留率仅有85.47%。

在水苏糖和蔗糖的降解规律上，米曲霉和黑曲霉很相似，即随着时间的延长，水苏糖、蔗糖都不断被降解，生成葡萄糖、果糖、甘露三糖等，米曲霉在发酵24 h后，水苏糖的保留率仅为92.27%，蔗糖的降解率为48.10%，前24 h内，米曲霉对蔗糖和水苏糖的分解速度要高于黑曲霉。在发酵36 h后，水苏糖的保留率降为88.56%，蔗糖的降解率增加到57.74%。

在前36 h内，随着干酪乳杆菌发酵时间的延长，蔗糖含量不断下降，水苏糖含量基本保持不变。在发酵36 h后，水苏糖的保留率为94.33%，蔗糖的降解率为28.39%。在48 h后，水苏糖的保留率降为89.54%，而蔗糖的降解率增加到49.08%。

随着瑞士乳杆菌发酵时间的延长，水苏糖缓慢地发生降解，而蔗糖被快速地降解生成葡萄糖和果糖。在发酵24 h 后，水苏糖的保留率为95.89%，蔗糖的降解率为30.61%；在36 h 后，蔗糖进一步被降解，降解率增加到53.36%，少量水苏糖被降解为甘露三糖，保留率为89.98%。

随着发酵时间的延长，蔗糖和水苏糖均缓慢地下降，鼠李糖乳杆菌能同时缓慢地代谢分解蔗糖和水苏糖。在发酵36 h后，大部分蔗糖还被保留在发酵液中，水苏糖的保留率为94.57%，而蔗糖的降解率仅有18.14%。

2.2 比较不同接种量菌株组合同步发酵过程中水苏糖和蔗糖浓度变化

图3 不同接种量菌株组合对水苏糖和蔗糖浓度的影响Fig.3 Effects of different inoculation amount combinations on the content of stachyose and sucrose

注：A为0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌；B为0.02%黑曲霉+0.02%乳杆菌；C为0.02%黑曲霉+0.01%乳杆菌；D为0.01%黑曲霉+0.02%乳杆菌。

发酵初始，体系中均添加0.05% EDTA。由图3可知，在4种不同接种量的混菌发酵组合中，以降解蔗糖降解率和水苏糖保留率为参考指标，纯化效果排序为：0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌>0.01%黑曲霉+0.02%乳杆菌>0.02%黑曲霉+0.01%乳杆菌>0.02%黑曲霉+0.02%乳杆菌。当2种菌株接种量都较大时，微生物在分解蔗糖和水苏糖上的优先顺序不明显，导致在相同发酵时间内，更多的水苏糖被降解为甘露三糖。同时，比较C和D的结果可知，当黑曲霉接种量较大时，发酵液中水苏糖降解速度更快，所以C与D相比，D保留水苏糖的效果会更好。在发酵36 h后，大部分的蔗糖基本被消耗，A、B、C和D的蔗糖降解率分别为88.03%、87.25%、87.44%、85.79%，其中0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌为最优发酵菌株组合。

2.3 对比不同样品的水苏糖含量

将不同菌种发酵得到的水苏糖发酵样品经过膜过滤、离子交换树脂脱色、阴阳离子交换树脂脱盐处理后，冷冻干燥，测定水苏糖浓度，结果见图4和图5。

图4 双菌种发酵对水苏糖含量的影响Fig.4 Effect of double-strain fermentation on the content of stachyose

注：A为原样纯化；B为0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌发酵36 h纯化；C为0.01%黑曲霉+0.02%乳杆菌发酵36 h纯化；D为0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌发酵45 h纯化；E为0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌36 h发酵样。

图5 0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌发酵36 h纯化HPLC图Fig.5 Purification HPLC chromatogram of 0.01%Aspergillusniger+0.01%Lactobacillus fermenting for 36 h

由图5可知，0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌组合的水苏糖含量略高于0.01%黑曲霉+0.02%乳杆菌组合，发酵36 h优于48 h。0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌混菌组合发酵36 h后，进行离心过滤、活性炭脱色、10 kD膜包过滤，使用D001和D301树脂床串联离子交换柱脱盐，冷冻干燥后，最终产品水苏糖含量高达78.13%。

3 结论

黑曲霉发酵36 h后，水苏糖的保留率为91.23%，蔗糖的降解率为65.59%，但黑曲霉对果糖的利用效果较差。与黑曲霉相比，米曲霉纯化水苏糖的潜力较低。干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌都较难发酵水苏糖。其中瑞士乳杆菌消除蔗糖的能力最强，鼠李糖乳杆菌降解蔗糖的能力最差，然而瑞士乳杆菌不能有效利用果糖易造成果糖累积。干酪乳杆菌在发酵36 h后，水苏糖的保留率为94.33%，蔗糖的降解率为28.39%。干酪乳杆菌能快速消耗果糖，保留水苏糖，但降解蔗糖能力较差。黑曲霉降解蔗糖的能力较强，但消耗果糖的能力较差。

混菌发酵纯化水苏糖的效果要优于单菌发酵，接种量最优的混菌发酵组合为0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌。通过添加蔗糖酶抑制剂EDTA二钠可使微生物水解糖的速度和消耗单糖的速度处于平衡状态，减缓水苏糖的降解速度。0.01%黑曲霉+0.01%乳杆菌混菌组合发酵36 h后，进行离心过滤、活性炭脱色、10 kD膜包过滤，使用D001和D301树脂床串联离子交换柱脱盐，冷冻干燥后，样品水苏糖含量高达78.13%。