基于顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术分析香芋南瓜叶片的香气物质成分及特征

2019-05-23 07:00李俊星钟玉娟罗剑宁何晓莉龚浩吴海滨晏石娟黄河勋
关键词:香芋挥发性南瓜

李俊星,钟玉娟,罗剑宁,何晓莉,龚浩,吴海滨,晏石娟,黄河勋*

(1.广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室,广州 510640;2.广东省农业科学院农业生物基因研究中心,广州 510640)

南瓜为葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita)中的一类重要的园艺经济作物。其中香芋南瓜为一类具有浓郁香味特征的南瓜品种,其叶片和果实在田间能散发出令人愉悦的芋香味。定性和定量地测定香芋南瓜的香气组成物质,对于南瓜香味育种与香味性状的有效利用具有重要的理论意义。香气挥发性物质主要包括酯类、醛类、醇类、萜类、酮类等化合物[1]。香气挥发性物质的种类、含量、阈值及其之间的相互作用决定着各类香型,只有把香气组分作为一个整体时,才具有特定香型[2]。另外,在挥发性物质中赋予特殊的香味属性的物质,称为特征香气成分[3]。对香气物质的分离提取及香气物质的鉴定是研究风味物质的关键。目前,对香气成分的研究常采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱技术(headspacesolid-phasemicroextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,HSSPME/GC-MS),它可以有效地定性和定量鉴别大量物质[4]。而对南瓜属材料的香味性状研究起步较晚,目前,少许文献报道主要集中在印度南瓜和美洲南瓜的南瓜子及南瓜子油等方面,由于供试材料的差异,香气组分结果也不尽相同[5-9]。周春丽等[5]在中国南瓜(蜜本)果实中定性和定量鉴定出44种化合物,主要由烯类、醇类、酯类、醛类等物质构成,而在印度南瓜(锦栗)果实中定性和定量鉴定出51种化合物,以羧基类、醇类、烷烃类为主,还有部分杂环类物质。笔者所在课题组培育出的有自主知识产权的、具有浓郁香味的香芋南瓜新品种,已在生产上推广应用,但是目前对它的鉴定主要依靠主观嗅觉,而由于检测者的阈值差异,使得感官差异较大,从而导致鉴定结果的准确性和可靠性难以保证。因此,需要对其香味性状进行准确、客观、数据化地鉴定。

本研究以香芋南瓜叶片为研究对象,以非香芋南瓜叶片为对照材料,利用HS-SPME结合GC-MS技术阐明香芋南瓜的香气物质种类及含量特点,初步明确其特征香气组分,并分析特征香气成分在不同发育阶段和不同节位叶片中的含量异同。本研究结果有助于进一步巩固香芋南瓜香气特征、风味性状分析的基础工作,拓宽南瓜香味性状研究,为后续分子标记的开发、苗期鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的香芋南瓜和非香芋南瓜材料种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云基地,都为中国南瓜类型。在坐果期分别取香芋南瓜和非香芋南瓜的成熟叶片,各3次生物学重复取样。并且在香芋南瓜伸蔓期和坐果期分别取中部叶和顶部新叶,共4个样本,各3次生物学重复取样。其中,伸蔓期中部叶片和顶部叶片分别命名为ZL和ZN,坐果期中部叶片和顶部叶片分别命名为WL和WN(图1),取样后立即用液氮冷冻,于-80℃条件下保存。

1.2 样品预处理及香气物质提取

将于-80℃条件下保存的叶片样本进行冷冻干燥后,研磨成粉,用于后期检测。

准确称取1 g粉状样品,放入20 mL顶空瓶中,加入5 mL饱和氯化钠溶液,并加入1 μL 3-壬酮(0.04 μg/μL)作为内标,迅速拧紧顶空瓶瓶盖,放入70℃水浴锅中,然后迅速插入固相微萃取装置(50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头,美国 Supleco公司),平衡2 min后,在70℃条件下吸附35 min。

图1 香芋南瓜不同发育时期及不同叶位的叶片Fig.1 Leaves from different development stages and nodes of Xiangyu pumpkin

1.3 香气物质的GC-MS检测及定性与定量分析

把萃取头插入色谱仪的进样口进行解吸附,进样口温度为270℃,解吸附时间为4.5 min。利用安捷伦7890B气相色谱串联7000D质谱仪对香芋南瓜和非香芋南瓜叶片样品的挥发性成分进行数据采集和分析。利用安捷伦7890A气相色谱串联5975C质谱仪对香芋南瓜不同发育阶段和不同叶位叶片样品的香气特征成分进行数据采集与分析。

气相条件:气相色谱柱DB-5MS(60 m×0.32 mm×0.25 μm);载气为氦气,流速为1.0 mL/min;进样口温度为270℃;程序化升温为50℃保持3 min,随后以5℃/min的速率上升至250℃,保持5 min。

质谱条件:电子轰击型离子源;电离电压70 eV;离子源温度230℃;四级杆温度150℃;接口温度280℃;扫描模式为全扫,m/z为35~450。

1.4 数据分析

香芋南瓜叶片挥发性物质数据分析:首先利用MassHunter(Qualitative Analysis B.07.00,美国安捷伦公司)软件对香芋南瓜叶片采集数据进行解卷积,并利用NIST 14标准谱库进行检索,根据烷烃标准品数据信息计算保留指数。定性分析标准为:1)经NIST 14库比对,质谱匹配总得分在70以上;2)实际保留指数与理论保留指数偏差在10以内。

香芋南瓜和非香芋南瓜叶片差异挥发性物质分析:利用MassHunter软件进行解卷积;解卷积后的数据文件导入MPP(mass profiler professional)分析软件中进行统计学分析,对GC-MS数据进行严格过滤,获得差异化合物,最后对差异化合物进行定性,鉴定香芋南瓜叶片中的特有挥发性化合物。MPP过滤参数:最小绝对丰度,5 000;组内化合物最小出现频率,60%;组内最大变异系数,30%。利用过滤后获得的化合物进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。同时,将过滤后的数据进行差异统计分析,其中:统计分析参数为P<0.05;最小差异倍数为2。

特征化合物在不同发育阶段和不同叶位叶片中的相对含量(按干质量计)的计算公式如下。

2 结果与分析

2.1 香芋南瓜叶片香气物质分析

利用GC-MS对香芋南瓜种质叶片的挥发性成分进行数据采集和分析。经NIST 14数据库检索和保留指数计算,共鉴定出28种香气物质,主要包括醛、醇、酮、酯、含氮化合物等物质,其中醇类物质最多,达到10种,峰面积为44 280 707,其次为醛类和酮类,分别为8种和4种,峰面积分别为28 914 525和6 639 896;单个化合物含量最高的为苯甲醛,其次分别为苯甲醇、1-辛烯-3-醇、3-己烯-1-醇、2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-AP)(表1)。

2.2 香芋南瓜与非香芋南瓜叶片香气物质差异分析

对香芋南瓜和非香芋南瓜叶片的挥发性物质采集数据进行过滤及统计,将所得的差异化合物利用质谱图和保留指数进行定性分析。首先将过滤后的数据进行主成分分析(PCA),PC1和PC2的贡献率分别为49.05%和21.40%(图2)。通过统计分析,最终获得香芋南瓜4种特有的差异化合物,包括2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙酰基吡咯、十一醇、水杨酸甲酯,其中含量最高的差异化合物为2-乙酰基-1-吡咯啉。

2.3 不同发育时期叶片香气特征成分变化

以4个不同发育时期的叶片样本(图1)为试验材料,我们分析了含量最高的差异挥发性物质2-乙酰基-1-吡咯啉在不同样本中的含量。结果(图3)表明:与坐果期叶片(WL与WN)相比较,伸蔓期叶片(ZL与ZN)中含有较高的2-乙酰基-1-吡咯啉,并且伸蔓期顶部叶片(ZN)比中部叶片(ZL)的含量更高,差异有统计学意义(P<0.05);而在坐果期的中部叶片(WL)和顶部叶片(WN)中该物质含量差异无统计学意义(P>0.05),但顶部叶片的含量略高。

表1 香芋南瓜叶片中香气挥发性成分鉴定结果Table 1 Identification result of aroma compounds in the leaves of Xiangyu pumpkin

3 讨论

香芋南瓜叶片和果实具有特殊的浓郁香味,是一类适宜进行南瓜香味性状分析的试验材料。本试验采用HS-SPME结合GC-MS技术对香芋南瓜叶片中的挥发性物质进行了分析,共鉴定出28种挥发性物质,可为后续的资源鉴定奠定基础。前人研究发现,醇类化合物一般气味柔和,醛类化合物一般阈值较低,对气味贡献较大,醇醛类物质通常具有绿色植物青香,内酯类物质通常具有甜香型的感官特征,酮类化合物赋予了一定的果香气味[10]。在本研究中,含量最高的苯甲醛呈现苦杏仁、樱桃及坚果香气[11];己醛与3-己烯-1-醇具有青草气味[12],可能是叶片草香味的主要贡献化合物;二氢猕猴桃内酯、香叶基丙酮及β-紫罗酮是中国台湾东方美人乌龙茶的主要香气成分[13]。这些物质在香芋南瓜叶片的香味性状中发挥着不同的作用。

香气特征化合物的鉴定对后续香芋南瓜香味性状的解析至关重要。本研究对香芋南瓜和非香芋南瓜叶片的挥发性物质进行了比较。首先利用化学计量学方法对二者的挥发性化合物进行了严格的数据过滤和统计分析,保证了化合物的组成和含量具有较好的重复性,最后筛选得到差异化合物。另外,PCA结果表明,香芋南瓜和非香芋南瓜的叶片挥发性物质有较好的差异区分,并且贡献率达到70.45%,能够充分保存样本的原始数据信息。在所获得的4种香芋南瓜特有的差异化合物中,水杨酸甲酯呈现薄荷味,十一醇呈现柑橘气味,2-乙酰基吡咯呈现核桃、坚果及面包香气(http://www.flavornet.org/),2-乙酰基-1-吡咯啉(2-AP)为香稻的特征香气成分[14],其在较低的含量时就能展现出强烈的风味,呈现典型的花香、甜香味,也有报道描述为典型的爆米花气味。2-AP在芋头中也被检测到[15]。因此,我们推测2-AP是香芋南瓜叶片呈现特殊香味特征的主要贡献物,在南瓜芋香味呈现中发挥着最主要的作用。通过分析2-AP在不同发育时期叶片中的含量发现,该物质在发育早期或是幼嫩叶片中含量更高。这与该物质在香稻叶片中的研究结果一致,即在香稻叶片中表现为叶尖中的含量高于叶片基部,嫩叶中的含量明显高于老叶[16]。这可能是伴随着叶片的发育衰老,该化合物合成的前体物质减少的缘故。总之,通过了解香芋南瓜叶片特征香气成分在不同发育阶段的含量,可以为以后通过叶片鉴别香味种质资源提供理论基础。

图2 香芋南瓜与非香芋南瓜叶片挥发性化合物的主成分分析Fig.2 Principal compound analysis of aroma compounds from Xiangyu and non-Xiangyu pumpkin leaves

图3 在不同发育阶段的香芋南瓜叶片中2-乙酰基-1-吡咯啉(2-AP)含量变化Fig.3 Content change of 2-acetyl-1-pyrroline(2-AP)in the leaves of different development stages of Xiangyu pumpkin

4 结论

在香芋南瓜叶片中共鉴定出28种挥发性物质,其中醇类、醛类及酮类物质含量最高。通过主成分分析能够将香芋南瓜和非香芋南瓜叶片的挥发性成分进行区分,并且获得了4类香芋南瓜特有的差异挥发性化合物。香芋南瓜叶片香味的主要贡献物2-乙酰基-1-吡咯啉在植株发育早期的叶片中含量高,且在幼嫩叶片中的含量明显高于老叶。

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