洛阳地区9种嗜尸性丽蝇28S rRNA和COⅠ基因序列分析

赵琳琳，翟仙敦，郑哲，吕宙，李永林，莫耀南

（1.河南科技大学法医学院，河南 洛阳 471003；2.西南政法大学刑事侦查学院，重庆 400031）

采用法医昆虫学（forensic entomology）的方法进行死亡时间（postmortem interval，PMI）推断有重要意义[1]。机体死后不同阶段，到达尸体上的嗜尸性昆虫种类不同，呈现较强的演替规律。丽蝇往往是第一批到达尸体并产卵的嗜尸性昆虫，但丽蝇种类繁多，需要积累更多的基因资源来进行鉴定研究。本研究通过细胞核28S核糖体核糖核酸（ribosomalribonucleic acid，rRNA）和线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因对洛阳地区常见嗜尸性丽蝇进行分子鉴定，以期作为形态学鉴定的重要方法补充，并完善嗜尸性丽蝇的鉴定系统。

1 材料与方法

1.1 蝇类样本采集

于2016年6月—2017年5月，诱捕采集放置于河南科技大学（洛阳）室外树荫下大鼠尸体上的嗜尸性丽蝇。共捕捉到3只丝光绿蝇Lucilia sericata（Meigen，1826）、3 只大头金蝇Chrysomya megacephala（Fabricius，1794）、2 只铜绿蝇Lucilia cuprina（Wiedemann，1830）、2 只叉丽蝇Triceratopyga calliphoroides（Rohdendorf，1931）、3 只 反 吐 丽 蝇Calliphora vomitoria（Linnaeus，1758）、3只巨尾阿丽蝇Aldrichina grahami（Aldrich，1930）、1只叉叶绿蝇Lucilia caesar（Linnaeus，1758）、3只亮绿蝇Lucilia illustris（Meigen，1826）、3只紫绿蝇Lucilia porphyrina（Walker，1856）。微量离心管分类单独密封包装后置于-20℃冰箱中保存。依据《中国常见蝇类检索表》进行形态学种类鉴定，并经专家再次确认。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

每个样本取腿4条，清洗、捣碎，用MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（日本TaKaRa公司）提取腿部DNA，置于-20℃保存备用。剩余样本组织装回原微量离心管，冷冻保存。

1.2.2 PCR扩增

采 用Premix TaqTM（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）试剂盒（日本TaKaRa公司）对28S rRNA基因中的目的片段和COⅠ基因经典DNA条形码引物（LCO1490/HCO2198）进行扩增。28S rRNA基因的扩增引物为：上游引物5′-GACTACCCCCTGAATTT AAGCAT-3′，下游引物 5′-GACTCCTTGGTCCGTGT TTCAAG-3′。

扩增总体系为 50 μL，内含 2×Premix Taq溶液（含DNA聚合酶、缓冲液、dNTP混合液）25μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板6 μL，ddH2O补足。PCR循环参数：94℃预变性1 min；94℃ 1 min，45℃ 1.5 min，72℃ 1.5 min，5个循环；94℃ 1 min，50℃ 1.5 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸8min。扩增产物于4℃保存。

1.2.3 电泳检测及测序分析

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（120V，30min），溴化乙锭染色，置于凝胶成像系统拍照分析。

测序引物为PCR扩增引物，扩增产物由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，正反向双向测序以保证序列的准确性。应用MEGA 7.0软件将所测23个样本的基因序列进行整理，在BLAST搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对。经MEGA 7.0软件比对，剪切为相同长度，然后按邻近法（neighbor-joining，NJ）对序列进行碱基组成、进化分歧率和系统发育树分析（以家蝇为外群），Bootstrap值为1000。

2 结 果

本研究共获得5属9种23个丽蝇样本的DNA，扩增产物使用分析软件剪去引物和杂带后，余下序列长度分别为715bp和637bp。

2.1 BLAST比对结果

28S rRNA和COⅠ基因序列的BLAST比对结果（表1～2）显示，所得样本DNA与GenBank中已知序列相似度较高（≥99%），与形态学鉴定结果相符，但28S rRNA序列比对结果中没有一致的叉丽蝇、巨尾阿丽蝇和紫绿蝇的基因序列，检索GenBank后亦未发现。

2.2 碱基组成分析

对所得23个样本的28S rRNA基因进行碱基组成分析，结果显示：保守位点678个，可变位点36个，其中简约性信息位点36个，自裔位点0个。碱基平均组成：A=34.1%，G=18.4%，C=13.2%，T=34.2%，A+T=68.3%，具有明显的A+T倾向性。

对所得23个样本的COⅠ基因进行碱基组成分析，结果显示：保守位点523个，可变位点114个，其中简约性信息位点112个，自裔位点2个。碱基平均组成：A=30.6%，G=15.7%，C=15.8%，T=37.8%，A+T=68.4%，具有明显的A+T倾向性。

表1 丽蝇科23个样本28S rRNA基因序列在线BLAST比对结果

表2 丽蝇科23个样本COⅠ基因序列在线BLAST比对结果

2.3 系统发育树分析

以家蝇（28SrRNA的GenBank登录号为KC177822.1，COⅠ的GenBank登录号为KF562113.1）为外群，GenBank中叉叶绿蝇的28S rRNA和COⅠ序列各两条纳入一并分析，运用MEGA 7.0软件对25个样本的基因序列进行分析，构建系统发育树，结果按照不同属、种分别聚类，分子鉴定结果和形态学鉴定结果一致（图1），效果较好。

28S rRNA基因序列构建的系统发育树显示：按照不同属种分别聚类，共5属9种，自上而下3只亮绿蝇、3只叉叶绿蝇、3只紫绿蝇、2只铜绿蝇、3只丝光绿蝇、2只叉丽蝇、3只巨尾阿丽蝇、3只反吐丽蝇、3只大头金蝇分别聚类，Bootstrap检验可信度分别为64%、93%、85%、97%、99%、64%、65%、64%和99%，绿蝇属的Bootstrap检验可信度为93%。

COⅠ基因序列构建的系统发育树显示：按照不同属种分别聚类，共5属9种，自上而下3只叉叶绿蝇、3只亮绿蝇、3只紫绿蝇、2只铜绿蝇、3只丝光绿蝇、3只巨尾阿丽蝇、2只叉丽蝇、3只反吐丽蝇、3只大头金蝇分别聚类，Bootstrap检验可信度分别为100%、98%、100%、85%、95%、100%、100%、100%和100%，绿蝇属的Bootstrap检验可信度为82%。

2.4 种内及种间进化分歧

经计算本研究中丽蝇科5属9种蝇类28S rRNA和COⅠ基因的遗传距离发现：不同蝇种28S rRNA基因序列种内差异为0，叉丽蝇、反吐丽蝇和巨尾阿丽蝇，叉叶绿蝇和亮绿蝇的种间差异均为0.001，叉丽蝇和反吐丽蝇，叉叶绿蝇和紫绿蝇的种间差异均为0.003，亮绿蝇和紫绿蝇的种间差异为0.004，丝光绿蝇和铜绿蝇的种间差异为0.008，其余种间差异为0.014～0.033；COⅠ基因序列种内差异为0～0.008，丝光绿蝇和铜绿蝇的种间差异为0.006～0.009，叉叶绿蝇和亮绿蝇的种间差异为0.011/0.013，其余种间差异为0.037～0.101。详见表3～4。

图1 基于25个样本28S rRNA和COⅠ基因序列构建的系统发育树

表3 25个样本28S rRNA基因序列的种间差异和种内差异

表4 25个样本COⅠ基因序列的种间差异和种内差异

3 讨 论

法医昆虫学中与PMI关系最为密切的是双翅目蝇类，主要包括以丽蝇科为代表的17科，有数百种嗜尸性蝇类[3]，而利用嗜尸性蝇类推断PMI的首要任务就是鉴定其种类。作为尸体上发育最早的昆虫，丽蝇科蝇种为实际案例应用中涉及最多的昆虫种类，常为推断PMI提供依据，是法医昆虫学中最有意义的种类。河南省地处中原，位于暖温带与亚热带，有记录的嗜尸性丽蝇多达14种之多[4]。鉴于案发现场提取的蝇类样本的多样性和复杂性，对于非昆虫专业人员很难从形态学鉴定其种属，尤其对苍蝇幼虫、蛹、卵生长发育规律的把握和形态学的鉴定，更是难上加难。自SPERLING等[5-6]将以DNA为基础的方法用于嗜尸性昆虫种类鉴定后，作为形态学鉴定方法的补充手段，DNA分子鉴定被越来越多的法医昆虫学研究者所接受。

线粒体COⅠ基因在动物学领域被作为种属遗传标记建立方法[7]后，因其具有拷贝数高、易分离、高保守性结构等特点，已被应用于法医昆虫学领域。而其中的DNA条形码区域序列测定被证实有益于各地双翅目的种属分子鉴定[8-12]。核基因28S rRNA具有重要的生物学功能，是真核生物染色体上编码核糖体大亚基的基因，在进化上比较保守，是研究生物系统发育较好的分子标记[13]。有学者提出，为提高种属鉴定的准确性，开发更多的遗传标记是一种可以选择的策略[12，14]。相较于线粒体COⅠ基因，嗜尸性蝇类28S rRNA基因研究较少。

本研究中9种23只丽蝇，基于28S rRNA和COⅠ基因序列的分子鉴定结果均与形态学鉴定分类结果一致。COⅠ序列种内差异为0～0.008，丝光绿蝇和铜绿蝇的种间差异为0.006～0.009，叉叶绿蝇和亮绿蝇的种间差异为0.011/0.013，其余种间差异为0.037～0.101。WELLS等[15]对丽蝇科mtDNA进行了测序及系统发育分析，发现COⅠ+COⅡ种间差异≥3%，而种内差异＜1%，由此根据COⅠ+COⅡ基因序列差异来判断丽蝇个体是否同种。按照此理论分析，本研究中COⅠ基因序列不能有效区分丝光绿蝇和铜绿蝇，叉叶绿蝇和亮绿蝇，而在其他蝇种之间均可有效区分。28S rRNA基因序列分析发现，叉丽蝇、反吐丽蝇和巨尾阿丽蝇，叉叶绿蝇和亮绿蝇的种间差异均为0.001，叉丽蝇和反吐丽蝇，叉叶绿蝇和紫绿蝇的种间差异均为0.003，亮绿蝇和紫绿蝇的种间差异为0.004，丝光绿蝇和铜绿蝇的种间差异为0.008，其余种间差异为0.014～0.033，其中只有大头金蝇和丝光绿蝇、铜绿蝇，丝光绿蝇和反吐丽蝇、巨尾阿丽蝇的种间差异≥3%，同理只可有效区分这些蝇种。

与COⅠ基因序列相比，28S rRNA基因序列种内、种间差异均较小，提示此现象与该基因序列本身关系较为密切。根据FRÉZAL等[16]的理论，用来界定物种种内、种间差异的值并非是一个定值，而应该根据实际情况加以修正。本研究中采用的28S rRNA基因序列种内、种间差异值的确定需要进一步研究和验证。值得注意的是，在COⅠ基因序列种间差异整体明显大于28S rRNA基因序列的情况下，丝光绿蝇和铜绿蝇的种间差异却与28S rRNA基因序列非常接近，因此推测对于区分近缘关系的丝光绿蝇和铜绿蝇，28S rRNA基因序列鉴定效力可能优于COⅠ基因序列，这有待于更多样本的验证。BLAST在线比对过程中没有发现一致的叉丽蝇、巨尾阿丽蝇和紫绿蝇的28S rRNA基因序列，说明该蝇种的相关研究较少，而本研究可以为此提供基础数据。

WELLS等[15]认为，分子鉴定即使不能够准确确定某一特定嗜尸性蝇种，至少可以把未知蝇种定位于某一特定的进化分支上。本研究中部分蝇种即使不能根据种内、种间差异来确定和区分，但所有样本均位于某一特定的分支上，Bootstrap检验可信度较高，并且两种分子标记系统发育分类一致，起到了很好的验证和补充作用。

综上所述，联合28S rRNA和COⅠ基因序列片段可以较好地区分本研究中的9种嗜尸性丽蝇，但对于近缘种丝光绿蝇和铜绿蝇，叉叶绿蝇和亮绿蝇的判定需要更多遗传标记的开发和联合应用。