南繁区玉米弯孢霉叶斑病菌的鉴定及其生物学特性研究①

郑肖兰 郑行恺 赵 爽 郑 浩 陆翠梅 蔡秀清 ③

(1中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口 571101；2海南大学热带农林学院 海南海口 570228；3农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室 海南海口 571101；4海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室 海南海口 571101)

玉米(Zea mays L.)为禾本科玉米属一年生草本植物[1]，经济价值很高，既可作粮食，也可用作工业原料和饲料。据考证，玉米栽培历史已有七千多年，是全世界分布最广种植最多的粮食作物之一。随着社会经济的发展，全球玉米的需求量均持续增长，是种植面积和产量增长最快的主要粮食品种之一。在中国的播种面积位居第三，仅次于谷类作物小麦和水稻，在世界上仅次于美国[2]。全世界主要在热带和温带地区种植广泛，海南因可播种冬玉米而成为中国玉米重要的南繁育种基地。因此，玉米在中国经济发展中占有重要地位，必须把保障玉米生产安全作为重中之重。作为中国第三大粮食作物，病虫害问题一直都是玉米稳产、高产的限制因素，而玉米弯孢霉叶斑病是海南省南繁种植区最严重的玉米叶部病害之一。据研究资料，在生产上，玉米因病害造成的损失可达6%～10%，严重时达到30%以上[3]。中国玉米病害主要有30余种，按其侵染类别可分为寄生性病害和非寄生性病害2类。玉米寄生性病害有小斑病、大斑病、茎腐病、枯萎病、矮花叶病毒病、根结线虫、根腐线虫病等。不适宜的生长条件都可能导致非寄生性病害的发生[2]。通过对玉米病害进行调查发现，由Curvularia lunata Boedijn引起的玉米弯孢霉叶斑病是夏玉米的主要病害，该病主要发生在热带及亚热带地区。据报道，在中国，弯孢霉叶斑病最早发生于水稻、高粱等作物[4]。自 1956年 Nel-son首次报道由弯孢霉菌引起玉米叶斑病，相继在美国、南斯拉夫、意大利、巴西、泰国、印度等国外玉米栽培区流行，并造成重大损失[5]。20世纪80年代初，在中国山东沿海地区曾有关于玉米弯孢菌叶斑病的报道，但未能确定其病原菌种类。1994年北京夏玉米重度发生了玉米弯孢菌叶斑病，发病率达60%。90年代中后期，在中国华北、东北玉米主产区该病发病较严重，群众开始称这种病害为黄斑病，通过对黄斑病病原进行研究发现，黄斑病的病原为新月弯孢霉[6]。

2010年玉米弯孢霉叶斑病在郑州市中度偏轻发生，局部中偏重发生，发生面积达 2.93万hm2，占玉米种植面积的19.2%，较往年重，发生盛期最高病株率、病叶率均达100%[7]。由于耕作制度的变更、品种的更换及全球气候变暖等原因，玉米弯孢菌叶斑病已成为严重危害玉米的重要病害之一[8]。目前国外学者的研究主要集中在病害造成的损失、玉米品种抗病性、弯孢菌生物学和致病作用及病害发生规律等方面的研究。赵来顺等[9]根据病斑的大小、颜色、形状以及产孢状况等特征，将玉米弯孢菌叶斑病的症状类型分成抗病型(R)、中间型(M)和感病型(S)3种。目前，从中国该病发生及危害的情况来看，重点防治对象为新月弯孢气生变种，即其优势致病菌。据Marci等[10]报道，该变种产生的毒素属于非寄主专化性毒素。吕国忠[11]、赵来顺等[9]也报道，玉米弯孢菌可以产生毒素，且毒素对寄主种子的萌发及胚根和胚芽生长都有抑制作用，可使幼苗枯死。

以往的研究区域均属于温带亚热带地区，而且都是针对玉米病虫害进行调查和病原的生物学特性及防治方法进行研究，而关于南方繁殖育种区玉米病害的相关研究尚未见报道。本研究特对热带地区海南南繁种植区玉米病虫害进行调查，期间笔者团队发现玉米弯孢霉叶斑病普遍发生。鉴于与以往报道该病害的地域差异大，促使笔者通过柯赫氏法则、生长速率测定法和血球计数板计数法等对此病害进行生物学特性方面的研究，为南繁区玉米弯孢霉叶斑病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

玉米弯孢霉叶斑病叶片，采集于三亚南滨农场南繁玉米种植基地。

1.1.2 供试菌

玉米弯孢霉叶斑病病菌C24，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离纯化保存。

1.1.3 供试培养基

PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米绿叶煎汁、玉米绿叶煎汁、PDA+玉米绿叶煎汁、燕麦。

1.1.4 供试试剂

琼脂，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，D-果糖，D-木糖，可溶性淀粉，L-丝氨酸，L-精氨酸，L-谷氨酰胺，L-赖氨酸，L-亮氨酸， L-缬氨酸，L-脯氨酸， 甘氨酸，苏氨酸， CaCO3，MgSO4·H2O，K2HPO4， KCl， NaNO3， FeSO4·7H2O， 四环素， 链霉素，HCl，NaOH等。

1.1.5 仪器设备

培养皿，锥形瓶，打孔器，酒精灯，超净工作台，显微镜，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，镊子，电子天平等。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米绿叶煎汁、玉米绿叶煎汁、PDA＋玉米绿叶煎汁、燕麦培养基成分及制备方法参考郑肖兰方法[12]。

各种培养基如果需要加入抗生素，则待培养基冷却至40～60℃，加入四环素(Tetracycline，Tet)50 μg/mL、 链霉素(Streptomycin， Str)100 μg/mL，摇匀倒平板备用。

1.2.2 样本采集、处理及分离培养

从三亚市南滨农场南繁玉米种植基地采集玉米弯孢霉叶斑病病叶，分装于封口样品袋中带回实验室进行保湿、镜检和分离培养等处理。参考郑肖兰等[13]分离方法，待长出菌落后移植到PDA平板上纯化、编号、保存，待鉴定。

1.2.3 病原菌的单孢分离

参照郑肖兰等[13]分离方法，使用灭菌牙签挑取含单孢的琼脂块放入PDA平板培养基，28℃下培养5d。

1.2.4 病原菌鉴定

(1)病原菌的形态特征观察和分离菌的验证参照郑肖兰等方法[12]；(2)真菌ITS保守序列扩增采用真菌ITS区段的通用引物 ITS1和ITS4；C24菌丝体收集及基因组提取、PCR扩增反应体系和扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测及后续的测序分析均参考郑肖兰等[14]方法。

1.2.5 病原菌生物学特性研究

下列研究均参照郑肖兰等方法[12]。

(1)培养基对C24菌丝生长影响测定；

(2)不同温度对参试菌C24菌丝生长影响测定；

(3)不同pH值对参试菌C24菌丝生长影响测定；

(4)不同碳源对参试菌C24菌丝生长影响测定；

(5)不同氮源对参试菌C24菌丝生长影响测定；

(6)光照对参试菌C24菌丝生长影响测定。

1.2.6 病原菌孢子形态观察 取菌株C24菌饼接种至100 mL的PDB液体培养基(成分除不添加琼脂外其余与PDA相同)中，在28℃下150 r/min振荡培养4 d，观察孢子形态及大小。

2 结果与分析

2.1 病害症状

田间调查发现玉米弯孢菌主要侵染玉米叶片，也可危害玉米叶鞘和苞叶。初生褪绿小斑点，逐渐扩展为圆形至椭圆形褪绿透明斑，病斑中间呈枯白色或黄褐色，四周有半透明浅黄色晕圈，边缘有较细的褐色环带，一般大小(0.5～4.0)×(0.5～2.0)mm，大的可达7.0×4.0 mm(图1)。湿度大时，病斑在玉米叶片正、反面均可产生灰黑色霉状物，即病原菌的分生孢子和分生孢子梗。发病严重时，病斑密布整片叶片，形成大面积坏死，直至整个叶片干枯死亡。

2.2 病原菌C24的形态学鉴定

图1 玉米弯孢霉叶斑病的症状

玉米弯孢菌C24在PDA培养基上菌落初始为灰白色，但随着菌落培养时间增加，分生孢子梗呈淡褐色至深褐色，有横隔，较直，孢痕明显 （图2）。分生孢子呈黑褐色，椭圆形或梭形，一般有3个隔膜，两端细胞钝圆，颜色较淡且稍小，而中部2个细胞颜色最深且较大(图3)。

图2 PDA培养基上菌株C24的菌落形态

图3 菌株C24的分生孢子形态

2.3 病原菌对玉米叶片的致病性

玉米叶片接种菌株C24后，第3天叶片产生病斑(图4)，病斑中间黄褐色，四周有半透明浅黄色晕圈，产生灰黑色霉状物。经比较可知，将从发病病斑中分离的病原菌接种至健康玉米叶片后的发病症状与田间表现相似，分离后获得的病原菌与原分离菌株相同，这些结果表示供试菌株C24为玉米叶斑病的病原菌。

2.4 病原菌的分子鉴定

图4 菌株C24对玉米叶片的致病性测定

菌株C24的rDNA-ITS保守序列扩增结果见图5。参试样品均能扩增出特异条带。经NCBI网站比对可知，菌株C24的rDNA-ITS扩增序列与Curvularia及Cochliobolus属中几株真菌序列相似性较高。系统进化分析结果显示(图6)，供试菌株C24与 GenBank中的 Curvularia lunata strain CX-3、Cochliobolus geniculatus、Curvularia lunata isolate CL-1等亲缘关系较近，其中与Curvularia lunata和Curvularia lunata strain CX-3序列同源性达到99%以上。结合形态学特征观察，将致病菌鉴定为玉米弯孢霉菌(Curvularia lunata)，属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、弯孢属、弯孢菌。

图5 C24的ITS保守区PCR扩增电泳图

2.5 不同培养基对菌株C24菌落生长的影响

图6 基于菌株C24的rDNA-ITS序列构建的系统发育树

图7 不同培养基对菌株C24菌落生长的影响

不同培养基对玉米弯孢菌C24菌落生长影响见图7。菌株C24在PSA培养基、PDA培养基、Cza pek培养基、PSA＋玉米绿叶煎汁培养基、玉米绿叶煎汁培养基、PDA＋玉米绿叶煎汁培养基、燕麦培养基等7种培养基上，25℃恒温下均能生长，然而不同培养基对菌落生长速度及形态影响差异显著。其中在燕麦培养基上生长最快，且菌落致密平展，绒状，菌落正面墨绿色，背面棕色，边缘整齐，所以较适合该菌株菌落生长的是燕麦培养基，其次是玉米绿叶煎汁培养基，再次为PSA＋玉米绿叶煎汁培养基和PDA＋玉米绿叶煎汁培养基，整体来说，该菌株在这些培养基上形成的菌落形状较不规则，边缘不整齐；在Czapek培养基上菌落虽生长速度适中，但菌落不致密，气生菌丝稀疏，灰白色；而在PDA培养基和PSA培养基上生长速度缓慢，这3种培养基均不适合菌落生长。同时试验发现，病原菌在PSA、PDA、PSA＋玉米绿叶煎汁、玉米绿叶煎汁和Czapek培养基上易产孢，且在PDA上产孢量最多，而在PDA＋玉米绿叶煎汁和燕麦培养基上未见产孢，由此可知PDA培养基较适合该菌产孢。

2.6 不同温度对菌株C24菌落生长的影响

不同温度对玉米弯孢菌菌株C24菌落生长的影响见图8。菌株C24在10～41℃均可生长，15℃以下时生长较慢，15～25℃该菌株的生长速度趋于稳定，而28～37℃生长速度最快，41℃时菌落生长速度有所下降。从结果推测C24适宜温度较广泛，相对更适合中温偏高的环境。

2.7 不同pH值对参试菌C24菌落生长的影响

图8 温度对菌株C24菌落生长的影响

不同pH值对玉米弯孢菌C24菌落生长影响见图9。不同pH对菌落生长速度影响差异显著。菌株C24在pH5～11均能生长，以pH 7～9菌落生长速度较快，而pH为5时该菌的生长速度最慢。

2.8 不同碳源对参试菌C24菌落生长的影响

不同碳源对玉米弯孢菌C24菌落生长影响见图10。试验结果表明，病原菌除了在以木糖、乳糖、蔗糖为碳源的培养基上生长不好外，在其他培养基上都可以较好地生长，但在以麦芽糖为碳源的培养基上生长最快。此外，除在以麦芽糖为碳源的培养基上菌落生长速度快于无碳源的对照以外，在其他6种碳源培养基上的生长速度均低于对照，但其气生菌丝密集度均高于对照；对照气生菌丝极少且贴着培养基表面伸展生长，无气生菌丝。而与无碳源的对照相比，碳源为可溶性淀粉和麦芽糖的培养基最适合菌落生长。

图9 不同 pH对菌株C24菌落生长的影响

图10 不同碳源对菌株C24菌落生长的影响

2.9 不同氮源对参试菌C24菌丝生长的影响

不同氮源对玉米弯孢菌株C24菌落生长影响见图11。该菌株在含不同氮源的培养基上的生长速度存在显著差异。与硝酸钠对照相比，氮源为L-亮氨酸的培养基最适合该菌落生长，在以L-精氨酸为氮源的培养基上菌落生长速度最慢。试验同时发现，菌株C24在以甘氨酸为氮源的固体培养基上产孢，在其它培养基未见产孢。

2.10 光照对参试菌C24菌落生长的影响

光照对玉米弯孢菌C24菌落生长的影响见图12，与黑暗条件相比，光照对菌落生长影响显著，说明光照有利于菌落生长。

3 讨论

图11 不同氮源对菌株C24菌落生长的影响

图12 光照对菌株C24菌落生长的影响

本研究采用常规组织分离法对采集的玉米弯孢霉叶斑病的病原菌C24进行分离纯化鉴定。结果表明，分离的病原菌C24接种至健康玉米叶片后，叶片产生的病斑与自然发病的病斑相同，且从发病的玉米叶片中分离出的病原菌与原分离菌株相同，结果显示参试菌株C24为玉米弯孢霉叶斑病的病原菌。

通过对玉米弯孢霉叶斑病菌C24生物学特性进行研究可知，该病原菌在PSA、PDA、Czapek、PSA＋玉米绿叶煎汁、玉米绿叶煎汁、PDA＋玉米绿叶煎汁、燕麦等7种培养基上，25℃恒温下均能生长，且在燕麦培养基上菌丝生长速度较快，而在PDA培养基和PSA培养基上菌落生长较慢。同时试验发现，病原菌在PDA、PSA、玉米绿叶煎汁、PSA＋玉米绿叶煎汁和Czapek培养基上产孢，且在PDA培养基上产孢量最多，说明该培养基较适合孢子生长。结合培养基配制、菌丝生长速率、产孢情况等综合分析，总体来说PDA培养基较为适合用于菌株C24的培养。

菌株C24的较适温度在28～37℃。白元俊等关于玉米弯孢霉叶斑病菌的生物学特性研究表明，该菌最适温度为30～32℃；白元俊等[15]、朱明旗等[16]关于玉米弯孢霉叶斑病的生物学特性研究表明，最适温度为25～30℃，这与本研究结果略有差异；此外，张定法等[17]对玉米弯孢霉叶斑病生物学特性的研究表明，菌丝生长的适宜温度为25～35℃，这与本研究结果基本一致，推测南繁区处于热带地区，常年高温，导致病原菌弯孢霉适应较高温天气。

本研究发现，菌株C24适应pH范围较广，在pH 5～11均能生长，菌丝生长的最适pH为7～9，这与梅丽艳等[18]的研究结果略有差异，其研究表明，pH为6～8时适宜菌落生长，最适pH为7，pH为6～8时产孢量最大。

光照对菌株C24菌落的生长影响显著。本研究结果显示，光照有利于菌落生长，这与白元俊等[15]研究结果存在差异。

此外，不同的碳源和氮源对该病原菌的生长影响差异较大。与对照相比，以麦芽糖为碳源的培养基最适合该菌落生长，这与朱明旗等[16]的研究结果基本一致。氮源为 -亮氨酸的培养基最适合菌落生长，以 -精氨酸为氮源的培养基较不适合菌落生长，且病原菌只在以甘氨酸为氮源的固体培养基上产孢。

综上所述，本研究结果与其他学者的研究结果既有相同之处又有不同之处，可能的原因是由于地域不同，导致病原菌的生物学特性有所差异。鉴于玉米弯孢霉叶斑病在玉米上造成较大危害，下一步工作重点对该病发生规律以及抗病品种培育等防治措施开展系统、深入的研究，以有效控制玉米弯孢霉叶斑病的危害。

4 结论

本研究以玉米弯孢霉叶斑病菌C24作为研究对象，对其进行生物学特性研究，得到该病原菌在燕麦培养基上生长最好，最适温度在28～37℃，最适pH为7～9，光照有利于菌丝生长，碳源为麦芽糖、氮源为L-亮氨酸的培养基最适合该菌落生长。