保护素对原代肺成纤维细胞炎症及纤维化增殖的影响

郑声星，潘静怡，谷丽君，杨静想，陈新瓯，李明，金胜威

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 麻醉与围术期医学科，浙江 温州 325027）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床上常见的病死率极高的急危重症[1-2]。成纤维细胞作为最广泛间质组成细胞，在ARDS早期可过度增殖并产生胶原蛋白，启动纤维化程序，最终导致肺纤维化[3]。研究表明成纤维细胞可作为炎症效应细胞分泌细胞因子如前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、肿瘤坏死因子-α及各种炎症介质如白细胞介素-8、6、10并且高表达环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等[4]。保护素DX（PDX）为内源性抗炎促炎症消退介质，在炎症反应中发挥抗炎作用[5]。我们曾报道PDX能抑制博来霉素诱导的肺纤维化[6]，然而PDX对于原代成纤维细胞早期纤维化增殖及炎症反应的影响仍然未知。故本研究培养原代小鼠肺成纤维细胞，观察PDX对肺成纤维细胞COX-2合成、PGE2表达以及其纤维化增殖转化、胶原蛋白合成的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 PDX购于美国Cayman公司，内毒素（LPS，E．coilserotype 055：B5）、辣根酶标记山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG购于美国Sigma公司，重组TGF-β1购于美国Peprotech公司，胎牛血清及DMEM培养基购于美国Life Technologies公司，BrdU细胞增殖试剂盒购于英国Promega公司，PGE2ELISA试剂盒购于美国R＆D公司，RNeasy试剂盒购于美国Qiagen公司，M-MLV反转录试剂盒购于美国Invitrogen公司，兔抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人Vimentin（波形蛋白）单克隆抗体、鼠抗人CD31单克隆抗体、兔抗人F4/80单克隆抗体以及兔抗人细胞角蛋白-8（cytokeratin-8）单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺成纤维细胞分离和培养：参照我们之前培养成纤维细胞方法[7]。具体如下：小鼠称体质量，腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉，完整取出心、肺、气管，分离肺并除去心脏和大气道，置于放有预冷的PBS（青霉素100 IU/mL、链霉素 100 IU/mL）的无菌培养皿中，反复用预冷的PBS液冲洗，用小剪刀将肺组织剪碎（＜1 mm3），加入0.25%胰蛋白酶（37 ℃预温）适量，用吸管反复吹打1.5 min， 加入含15% FBS的DMEM培养液终止消化，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，置于培养皿中，再加入少量15% FBS的DMEM培养液悬浮组织块，加入培养液以不飘起组织块为宜。37 ℃、5% CO2培养箱培养，1～2 d细胞爬出，加15% FBS的DMEM培养液（勿让组织飘起）。细胞接近融合时，按1:2接种传代，40 min后换培养液（差速贴壁法）。4～6代细胞用于实验。

1.2.2 HE染色：将传代的成纤维细胞消化成细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为1×104/mL，接种于24孔板内，吸弃上清液，加95%乙醇50 min，加入苏木素20 min染核，纯净水洗1遍，0.1%盐酸乙醇分化1 min，再用纯净水洗1遍，温水返蓝1 min，最后伊红染5 min，倒置显微镜下观察。

1.2.3 免疫荧光鉴定：将传代的成纤维细胞消化成细胞悬液，计数细胞，调整细胞密度为1×104/mL， 接种于24孔板内，吸去培养孔中的培养液，加入含4%多聚甲醛的0.01 mol/L PB（pH 7.2）1 mL，室温下固定30 min，PBS洗3次，含0.2% Triton的PBS洗2次，再PBS洗2次，10%山羊血清的0.01 mol/L PBS（pH 7.2）封闭40 min（室温），保持湿度一抗孵育过夜（4 ℃），次日晨用PBS洗3次，每次5 min，加结合有FITC的二抗（避光）室温孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI复染核15 min，PBS洗1次，荧光显微镜（Nikon eclipse 90i，Tokyo，日本）下观察检测成纤维细胞vimentin、CD31、F4/80以及cytokeratin-8的表达情况。

1.2.4 实验分组：LPS诱导急性炎症模型：①Control组：无任何处理；②LPS组：LPS（1 μg/mL）刺激6 h；③PDX+LPS组：PDX加LPS（1 μg/mL）刺激6 h。 TGF-β1诱导纤维化增殖模型：①Control组：无任何处理；②不同浓度TGF-β1组：不同时间点（24、48、72 h）给予不同浓度TGF-β1（1、10、20 ng/mL）； ③不同浓度PDX+TGF-β1组：给予不同浓度（0、1、10、100 nmol/mL）PDX加上TGF-β1（10 ng/mL）刺激48 h。药物刺激前均无血清DMEM培养基培养24 h。

1.2.5 Western blot检测COX-2 蛋白的表达：取 1 μg/mL LPS合并PDX诱导培养6 h后的肺成纤维细胞，加入适量细胞裂解液，冰上孵育50 min， 12 000 r/min离心20 min。采用BCA试剂盒测蛋白浓度。取总蛋白进行电泳，然后电转膜上。把膜放入含5 g脱脂奶粉中室温封闭1 h，加入COX-2一抗1:1 000，4 ℃摇动过夜。次日室温下TBST洗膜3次，每次15 min，接着加入辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体（1:2 000稀释），在室温下轻轻摇动1 h，然后洗膜3次，每次15 min。最后按化学发光显影试剂盒（ECL）要求加ECL试剂，室温下温育2 min后仪器进行曝光。在凝胶成像分析系统（Bio-Rad，美国）中测量目的蛋白特异性条带相对表达强度（灰度值），再与内参相对表达强度进行比较，得出相对比值。

1.2.6 ELISA法检测细胞上清液中PGE2的含量：LPS 和（或）PDX作用结束后收集细胞上清液，2 000 r/min 离心 5 min后待测。按照R＆D公司ELISA试剂盒说明书操作，检测细胞上清液中PGE2的含量。

1.2.7 BrdU细胞浓度测定试剂盒检测细胞存活度：将分离纯化的4-6代细胞以4×105～8×105cells/mL 进行铺板（96孔，100 μL/孔，5复孔）；细胞去血清化24 h后，应用PDX、TGF-β1等对细胞进行干预。培养24 h后，加入20 μL试剂盒增殖溶液。培养箱培养1.5 h。每孔内加入反应终止液终止反应。酶标仪检测490 nm吸光度值，应用培养液替代样品为阴性对照组。各孔检测的吸光度值减去阴性对照组的吸光度值。

1.2.8 Real time PCR检测胶原蛋白1α1（collagen 1α1）、胶原蛋白1α2（collagen 1α2）、α-SMA和纤连蛋白（fibronectin）mRNA的表达：取10 ng/mL TGF-β1+ PDX（100 nmol/mL）诱导培养48 h的小鼠原代肺成纤维细胞，根据说明书使用RNeasy试剂盒纯化RNA。采用M-MLV反转录试剂盒进行RNA反转录，获得cDNA。PCR引物序列如下：collagen 1α1的正向引物为5’-GAAGCACGTCTGGTTTGGA-3’，反向引物为5’-ACTCG AACGGGAATCCATC-3’；collagen 1α2的正向引物为5’- CCAACAAGCATGTCTGGTTAGGA-3’，反向引物为5’-TCAA ACTGGCTGCCACCAT-3’；α-SMA的正向引物为5’-GTCCCA GACATCAGGGAGTAA-3’，反向引物为5’-TCGGATACTTCAG CGTCAGGA-3’；fibronectin的正向引物为5’-AAGACCA TACCTGCCGAATG-3’，反向引物为5’-GAACATGACCGATTT GGACC-3’。把板置于LightCycler 480实时定量PCR反应仪上进行检测，95 ℃ 7 min预热，95 ℃ 18 s，56 ℃ 18 s，第二步至第三步共进行40个循环。根据CT值和标准曲线计算，并根据2-ΔΔCT计算基因相对表达水平[8]。

1.3 统计学处理方法 以GraphPad5.0软件进行分析处理。所有数据以±s表示，采用单因数方差分析进行组间比较，再进行方差齐性检验后，方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet’sT3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺成纤维细胞纯化及鉴定 组织块贴壁培养1～2 d后显微镜下可见长梭型细胞从组织块中爬出，3～5 d后细胞生长迅速并接近融合。成纤维细胞较大，呈突起的纺锤形或星形的扁平状结构，核椭圆形，核仁明显，细胞伸出多个突起（见图1）。传代后的肺成纤维细胞几乎长满整个培养瓶，偶见其他非成纤维细胞，细胞增殖能力强，但连续传4～6代后，细胞增殖能力逐渐下降。免疫荧光检测肺成纤维细胞呈vimentin（成纤维细胞标记）阳性，CD31（内皮细胞标志）阴性，F4/80（巨噬细胞标记）阴性，cyto-keratin-8（上皮细胞标记）阴性，见图2。

图1 传代后肺成纤维细胞（HE，×200）

2.2 PDX对于LPS刺激原代肺成纤维细胞COX-2蛋白表达的影响 Western blot结果显示正常小鼠原代肺成纤维细胞存在COX-2蛋白微量表达；LPS刺激诱导下，COX-2蛋白大量表达；PDX能抑制LPS诱导的COX-2蛋白的表达。Control组与LPS组比较差异有统计学意义（P＜0.01），LPS组与LPS+PDX组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

2.3 PDX对于LPS刺激原代肺成纤维细胞上清液PGE2含量的影响 PDX能抑制LPS诱导后原代肺成纤维细胞上清中PGE2的含量。Control组与LPS组比较差异有统计学意义（P＜0.01），LPS组与LPS+PDX组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。

2.4 不同浓度TGF-β1刺激不同时间后细胞存活度检测 在TGF-β1的刺激下，小鼠原代肺成纤维细胞出现了增殖反应，3个浓度TGF-β1组与Control组相比，均出现了增殖反应（P＜0.01）。在24、48 h，TGF-β110 ng/mL组与其他各浓度组比较细胞增殖反应更大 （P＜0.05），在各个浓度的不同刺激时间里，48 h时细 胞增殖反应较大（P＜0.05），因此可以确定TGF-β1刺激致细胞纤维增殖模型的最适刺激浓度为10 ng/mL， 最佳刺激时间为48 h。见图5。

图2 肺成纤维细胞免疫荧光检测结果（DAPI为细胞核染色，Merge为叠加图，×200）

图3 PDX抑制LPS诱导的肺成纤维细胞COX-2蛋白表达

图4 PDX抑制LPS刺激6 h肺成纤维细胞的PGE2表达

2.5 PDX对TGF-β1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞增殖的影响 实验结果显示，PDX呈剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞增殖。Control组与TGF-β1组比较差异有统计学意义（P＜ 0.01）；PDX组与Control组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；100 nmol/L PDX组显著抑制学报纤维化增殖，与TGF-β1+PDX 1 nmol/L组、TGF-β1+PDX 10 nmol/L组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。后续实验选择100 nmol/L作为PDX的浓度。见图6。

图5 不同剂量不同时间TGF-β1诱导对原代肺成纤维细胞增殖的影响

图6 PDX以剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞的增殖

2.6 PDX对于TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞胶原蛋白合成以及α-SMA和fibronectin基因表达的影响 α-SMA以及fibronectin是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的标志物[9]。实验结果表明，TGF-β1能促进原代肺成纤维细胞collagen 1α1、collagen 1α2的合成以及α-SMA、fibronectin的基因表达，TGF-β1组与Control组相比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；PDX能抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞collagen 1α1、collagen 1α2的合成以及α-SMA、fibronectin的基因表达，TGF-β1组与TGF-β1+PDX组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图7。

3 讨论

图7 PDX抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞胶原蛋白的合成、fibronectin 基因及α-SMA的基因表达

ARDS分为3个阶段[10]，初始化阶段为急性炎症期，炎症期后为纤维增生期，在此期间间充质细胞，特别是间质成纤维细胞增殖并分泌细胞外基质蛋白质如胶原蛋白[11]，如果这时炎症还不能消退，会进入肺纤维化阶段。ARDS 3个阶段互相交叉重叠，而成纤维细胞的激活是其交叉重叠的标志[12]。成纤维细胞不仅能促进组织修复，而且能调节炎症发生发展及消退过程[12]。我们之前的研究表明，成纤维细胞在LPS诱导下能表达COX-2并伴随PGE2的产生[7]。COX-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的限速酶[13]，其在呼吸系统炎症发生发展过程中起到至关重要的作用。故本研究采用LPS诱导原代成纤维细胞建立体外炎症模型。

PDX是抗炎促炎症消退脂质介质家族成员之 一[5]。研究表明PDX降低活性氧生成，抑制中性粒细胞脱粒、浸润[14]，并且能降低脓毒血症患者的生存率[15]。本研究表明，PDX能抑制LPS诱导的原代肺成纤维细胞COX-2蛋白的表达，ELISA法检测发现，PDX能降低LPS刺激后肺成纤维细胞上清中PGE2的水平，提示在ARDS早期炎症阶段PDX能抑制炎症瀑布样扩大，从而改善ARDS预后。

研究表明ARDS早期就可出现纤维化增殖，如增殖反应未减弱，会导致临床预后不佳[6]。这种纤维化增生阶段是一种潜在的可逆状态，被视为ARDS治疗过程中的最佳靶点[16]。炎症反应中成纤维细胞被过度激活，分泌炎症因子，同时过度纤维化增殖并促进其I胶原蛋白的合成及向肌成纤维细胞转化，最终导致肺功能障碍及肺纤维化[17]。因此可通过抑制肺成纤维细胞早期纤维化增殖及胶原蛋白的合成，促进肺功能的恢复，改善ARDS的转归和预后。α-SMA是成纤维细胞激活的标志。纤维化过程中I型胶原蛋白会大量合成并堆积，故影响I型胶原表达的因子是抗纤维化的研究重点[18]。TGF-β1能介导成纤维细胞纤维化增殖、向成纤维母细胞的转化以及纤维化相关基因的表达[19-20]。因此本实验采用不同浓度TGF-β1刺激原代成纤维细胞不同时间建立纤维化模型，发现采用10 ng/mL TGF-β1刺激原代成纤维细胞48 h建立纤维化模型是比较合理的。研究发现PDX能抑制博来霉素诱导的肺纤维化，抑制上皮细胞向间质转化，促进其肺功能恢复[6]。本实验结果表明PDX能通过剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞的增殖，同时能抑制其I型胶原蛋白合成以及α-SMA和fibronectin基因的表达。

综上所述，PDX能抑制LPS诱导的小鼠原代肺成纤维细胞COX-2表达，抑制TGF-β诱导的小鼠原代肺成纤维细胞纤维化增殖转化。