羟基红花黄色素A对卵巢癌细胞PI3K/Akt信号通路的影响

梁若笳应家乐 朱 磊

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤，术后以顺铂为基础的联合化疗是目前的基础治疗。化学增敏和预防治疗抗性具有重要的临床意义。近来研究发现，卵巢癌细胞耐药性的发展与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相关，而 MAPK/ERK、PI3K/ART、PKC/GSK-3β 等多条信号通路均参与调控肿瘤细胞EMT，其中PI3K/Akt信号通路是细胞外信号向细胞内传导的重要途径，与卵巢癌的发生、发展密切相关[1-2]。羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是中药红花的水溶性提取物，具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移的双重作用，但具体机制尚不明确[3]。本研究旨在观察HSYA在逆转A2780/DDP的顺铂耐药中的作用及对PI3K/Akt信号通路的影响，探讨HSYA逆转卵巢癌顺铂耐药的分子机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康BALB/C雌性裸鼠20只，3～4周龄，体质量18.0～20.0g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司 [实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]。SPF条件下饲养于浙江省实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2014-0008]，温度（24±2）℃，湿度（55±5）%，每 12h予亮暗循环，2周更换1次敷料，用无菌水及饲料饲养。

1.2 细胞株 顺铂耐药人卵巢癌细胞株A2780/DDP，购于中科院上海细胞库。

1.3 实验药物及试剂 HSYA购于江苏江阴天江药业有限公司，批号146087-19-6，纯度：＞98%；DDP购于德州德药制药有限公司，批号37020523；RPMI 1640培养基，批号61870044、DMEM培养基，批号10569044、胰酶，批号25200072均购于Gibco公司；胎牛血清，批号51342购于Hyclone公司；磷酸盐缓冲液 （phosphate buffered saline，PBS），批号 0061购于福州迈新生物技术有限公司；ECL Plus试剂盒，批号1705060购于Bio-Rad公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，批号P0015L、RIPA细胞裂解液，批号P0013B、BCA蛋白浓度测定试剂盒，批号P0009均为碧云天公司产品；Tris碱，批号10708876001购于Sigma 公司；兔抗 Akt，批号 9272、兔抗 p-Akt，批号81283、兔抗GAPDH批号2118S均购于CST公司。

1.4 实验器材与设备 3111型二氧化碳培养箱为Thermo公司产品；RM2135型轮转式切片机、HI1210型摊片机、HI1220型烘片机均为Leica公司产品；BH2型显微镜购于Olympus公司；BM-1000型光学显微镜购于南京江南永新光学有限公司。1681130-4B型酶标仪、Mini-Proten Tetra System型电泳系统和ChemiDocTMTouch Imaging System型凝胶成像仪均购于Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 A2780/DDP细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100ng/mL链霉素和2μg/mL DDP的1640培养基中，保持培养箱温度为37℃，CO2浓度为5%。取对数生长期细胞造模。

2.2 裸鼠移植瘤模型构建 制备单细胞悬液，调整细胞浓度至5×106个/mL，在超净台内对20只裸鼠进行接种。将细胞悬液注入实验裸鼠右侧腋窝皮下，每只0.2mL，待皮下移植瘤长至直径3mm时即为顺铂耐药卵巢癌模型鼠造模成功。

2.3 分组及药物干预 成功接种2周后每只模型鼠皮下移植瘤体积约60mm3。采用随机数字表将模型鼠分为对照组、红花组、顺铂组和联合组，每组5只。对照组以0.9%氯化钠溶液腹腔注射，红花组予HSYA 1.1g/kg腹腔注射，顺铂组予顺铂3mg/kg腹腔注射，联合组予 HSYA（1.1g/kg）联合顺铂（3mg/kg）腹腔注射。每3天1次，连续给药4周。

2.4 观察小鼠生长情况 5周后处死小鼠，解剖取肿瘤放于电子天平称重，记录瘤体重量，并计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（对照组瘤体质量-实验组瘤体质量）/对照组瘤体质量×100%。

2.5 病理观察 取一部分肿瘤组织经甲醛固定后石蜡包埋，切片，常规HE染色后镜下观察肿瘤形态学改变。

2.6 Western blot检测 取每组剩余肿瘤组织研磨，离心，使用考马斯亮蓝染料法测定蛋白浓度。用SDS-PAGE缓冲液稀释等量蛋白，再进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，分离的蛋白带电转至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶室温封闭1h，分别用Akt、p-Akt和Gapdh单克隆抗体孵育4℃过夜。Tris缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1h，Tris缓冲液洗膜，加入ECL，混匀后加在PVDF膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。使用Image J软件分析各条带光密度。

2.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差（±s） 表示，不同组间瘤重、体积等比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 各组小鼠肿瘤HE染色结果（HE染色 200×）

图2 HSYA对小鼠肿瘤组织内Akt、p-Akt表达的影响

3 实验结果

3.1 各组小鼠肿瘤生长情况比较 小鼠肿瘤大体观察，与对照组比较，顺铂组、联合组小鼠瘤体质量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），红花组小鼠瘤体质量差异则无统计学差异（P＞0.05）；与顺铂组比较，红花组、联合组瘤体质量差异有统计学意义（P＜0.05）；与红花组相比，联合组瘤体质量差异有统计学意义（P＜0.05）。与顺铂组相比，联合组抑瘤率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠肿瘤质量、抑瘤率比较（±s）

表1 各组小鼠肿瘤质量、抑瘤率比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与顺铂组比较，△P＜0.05；与红花组比较，▲P＜0.05；对照组以0.9%氯化钠溶液腹腔注射；红花组予HSYA 1.1g/kg腹腔注射；顺铂组予顺铂3mg/kg腹腔注射；联合组予HSYA（1.1g/kg）联合顺铂（3mg/kg）腹腔注射；HSYA：羟基红花黄色素A

组别对照组顺铂组红花组联合组鼠数 抑瘤率（%）5 5 5 5肿瘤质量（g）4.71±0.17 3.53±0.28*4.54±0.25△2.76±0.17*△▲25.08 3.61 41.36△

3.2 各组小鼠肿瘤形态学变化比较 对照组及红花组细胞形态较为一致，核质比例高，顺铂组及联合组出现不同程度的片状坏死区，部分细胞出现细胞核固缩及碎裂，联合组肿瘤坏死程度较顺铂组高。见插页图1。

3.3 HSYA对小鼠肿瘤组织Akt、p-Akt表达影响Western blot结果显示，与对照组比较，顺铂组Akt、p-Akt蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），而红花组与联合组的Akt、p-Akt蛋白表达低于对照组与顺铂组，差异有统计学意义（P＜0.05）。HSYA可以下调Akt、p-Akt蛋白质表达。见插页图2、表2。

表2 各组小鼠肿瘤组织Akt、p-Akt蛋白表达比较（±s）

表2 各组小鼠肿瘤组织Akt、p-Akt蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与顺铂组比较，△P＜0.05；对照组以 0.9%氯化钠溶液腹腔注射；红花组予HSYA 1.1g/kg腹腔注射；顺铂组予顺铂3mg/kg腹腔注射；联合组予HSYA（1.1g/kg）联合顺铂（3mg/kg）腹腔注射；Akt：蛋白激酶 B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶 B；HSYA：羟基红花黄色素A

组别对照组顺铂组红花组联合组鼠数5 5 5 5 Akt蛋白0.61±0.11 0.62±0.09 0.42±0.10*△0.44±0.07*△p-Akt蛋白0.59±0.02 0.59±0.04 0.54±0.05*△0.56±0.05*△

4 讨论

卵巢癌是女性常见癌症，约占女性新发癌症病例的4%[3]。目前临床上以顺铂为主的化疗是杀死卵巢癌细胞的主要手段。但化疗后的获得性耐药是导致肿瘤复发和进展主要原因。

卵巢癌对顺铂耐药的分子机制尚不明确，近年研究发现与EMT状态密切有关。其中参与调控卵巢癌EMT的PI3K/AKT信号通路已被证实在多种癌症中被激活，目前已成为研究及干预卵巢癌耐药的热门靶点。作为细胞生存的重要通路，PI3K/Akt信号通路在促进增殖和侵袭、抑制凋亡、促进血管生成、抵抗放化疗等方面起着重要作用[4]。PI3K是一种磷脂激酶，由催化亚基（p110）和调节亚基（p85）组成，其主要下游效应物丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，也称为蛋白激酶，活化的Akt在调节细胞存活、增殖和凋亡中起重要作用[5]。Huang等[6]采用阵列CGH来分析卵巢癌中的遗传畸变，确定PI3K/AKT途径是遗传水平上最常受影响的癌症途径。70%左右的卵巢癌伴有PI3K/AKT/mTOR的激活，促进过度活跃的细胞生长、增殖、生存、代谢和血管生成[7]。研究发现，Akt激活能提高卵巢癌细胞的存活，并通过衰减的p53促凋亡信号促进化学抗性[8]。Yang等[9]研究发现，PI3K/AKT对人上皮性卵巢癌顺铂耐药有显著影响，而抑制PI3K/AKT通路能显著增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性。Wang等[10]进一步发现，与单独使用顺铂比较，联合AKT抑制剂哌立福能显著增加卵巢子宫内膜样腺癌细胞凋亡，改善肿瘤控制情况。

红花黄色素源自中药红花，其有效成分HSYA具有促进肿瘤凋亡、干扰血管生成、抑制转移的作用[11]。本研究显示，与对照组与顺铂组，红花组小鼠的瘤体重量、抑瘤率没有统计学差异，病理也无明显的肿瘤凋亡，说明单纯使用红花没有明显抑制肿瘤的效果。然而，与顺铂组相比，同时应用顺铂和HSYA能够有效抑制A2780/DDP的生长。Western blot结果显示，红花组和联合组Akt、p-Akt蛋白均有下降。基于以上实验结果，我们猜测，HSYA增强A2780/DDP对顺铂的敏感性、逆转顺铂耐药的机制在于下调PI3-K/AKT途径的Akt、p-Akt蛋白表达。

综上所述，本研究结果显示HSYA可能通过下调PI3K/AKT途径的关键组分Akt、p-Akt蛋白，来增强A2780/DDP对顺铂的敏感性，逆转顺铂耐药。关于HSYA是否会通过其他信号转导机制抑制人卵巢癌A2780/DDP细胞生长，尚需进一步深入研究。