食管鳞状细胞癌中单羧酸转运蛋白4的表达及对EC109细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

刘耀河，秦 宁，杨 瑜，宋 锐，侯 歌，王 成，郭振江，梁 冰，张 艳，刘宗文

1)郑州大学第二附属医院放射治疗科 郑州 450014 2)郑州大学第二附属医学肿瘤内科 郑州 450014 3)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

食管癌是我国常见的消化道肿瘤，其中超过90%的病理类型都是鳞状细胞癌(以下简称鳞癌)[1-2]。癌细胞的代谢模式是在氧气充足的条件下以糖酵解为主并获取能量，称为 Warburg效应，且这一代谢模式的改变会产生大量的乳酸。单羧酸转运蛋白4(monocarboxylate transporter 4, MCT4)是单羧酸转运蛋白家族中的一员，它的主要功能是将胞内的乳酸转运到胞外，这不仅可以维持胞外低酸的微环境，还可以让胞内糖酵解顺利进行[3-4]。作为乳酸转运的主要参与者，MCT4在食管腺癌和胃癌等多种肿瘤中高表达，且影响预后[5-6]。有研究[7-8]发现，下调MCT4的表达以减少乳酸的外排，可以显著减弱结直肠癌和宫颈癌细胞的恶性生物学行为。本实验分析了食管鳞癌细胞和组织中MCT4的表达，观察下调MCT4表达对食管鳞癌EC109细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、组织及主要试剂

1.1.1 组织来源 选取郑州大学第二附属医院病理科2014至2015年的食管鳞癌组织标本60例，另取癌旁正常食管黏膜组织(距癌灶3 cm以外)19例，均经病理证实。患者手术前均未接受放化疗等治疗，手术方式为食管癌根治切除术。其中男39例，女21例；≥65岁28例，<65岁32例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期30例，Ⅲ+Ⅳ期30例；病理分级高中分化42例，低分化18例；有淋巴结转移31例，无淋巴结转移29例。

1.1.2 细胞株 正常食管上皮细胞Het1-A和食管鳞癌细胞EC109和EC9706均由郑州大学第二附属医院消化研究所捐赠。

1.1.3 主要试剂 鼠抗人单抗MCT4、鼠抗人单抗GAPDH和鼠抗人单抗β-tublin分别购自于美国Santa Cruz公司、武汉三鹰生物技术有限公司和Absin公司。Lipofectamine 3000购于美国Invitrogen公司。靶向MCT4的siRNA(MCT4-siR)和阴性对照siRNA(NC-siR)购于生工生物工程(上海)股份有限公司，序列见表1。通用SP免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥有限公司。凝胶制备试剂盒和CCK8 试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，Matrigel基质胶购于美国 BD公司，Transwell小室购于美国Corning公司。乳酸测定试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。

表1 siRNA序列

1.2食管鳞癌组织和细胞中MCT4蛋白的检测

1.2.1 免疫组化法检测组织中MCT4蛋白 将新鲜的组织标本于多聚甲醛中脱水固定，过夜后石蜡包埋，3～5 μm厚切片，然后经脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、封闭等步骤，滴加MCT4单抗(稀释度1∶200)4 ℃过夜，滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。以PBS作为阴性对照。于200倍镜下观察，细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。于200倍镜下观察，选取5个视野，计数500个细胞。按照染色强度评分：不显色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。按照阳性细胞百分比评分：<5%计0分，5%～计1分，10%～计2分，50%～计3分，≥75%计4分。两项评分相加，<6分为低表达，≥6分为高表达。由两名病理科专家使用双盲法阅片评分，当两人结果不一致时，请第3位病理科医生定夺。

1.2.2 Western blot法检测细胞中MCT4蛋白的表达 取对数生长期的Het1-A、EC109和EC9706细胞，以每孔2×105个/mL接种于6孔板中，当细胞融合度达到80%～90%时，用胰蛋白酶洗脱细胞，PBS洗涤2次，用离心管收集后加入裂解液，冰上裂解30 min，BCA法测量蛋白浓度。根据凝胶制备试剂盒说明书配制凝胶，上样量为25 μg。恒压90 V30 min后转恒压120 V，转移至PVDF膜，恒流300 mA转膜75 min。用含有吐温20和脱脂乳的TBST(pH 7.8)室温下封闭2 h；加一抗(MCT4抗体稀释度1∶200，GAPDH抗体稀释度1∶2 000)4 ℃孵育过夜；加二抗室温孵育2 h；化学发光显色，暗室曝光。实验重复3次。用Image J进行定量分析，计算目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值的比值，以此表示目的蛋白表达水平。

1.3下调MCT4表达后EC109细胞生物学行为的变化

1.3.1 实验分组 取对数生长期的EC109细胞，以每孔2×105个/mL接种于6孔板。实验分为3组，分别为空白对照组、NC-siR组和MCT4-siR组，每组3个复孔。避光条件下，当细胞融合度达到50%～60%时，NC-siR组和MCT4-siR组利用lipofectmine3000分别转染NC-siR和MCT4-siR，饥饿转染6 h后更换为完全培养基。

1.3.2 细胞中MCT4蛋白的表达 用胰蛋白酶将各组细胞洗脱下来，PBS洗2次，冰上裂解30 min，BCA法检测蛋白浓度，Western blot法检测MCT4蛋白，内参为β-tublin,方法同前。

1.3.3 细胞外乳酸含量的测定 转染72 h后，更换新鲜培养基培养24 h,将细胞培养基转移至EP管中，依照乳酸测定试剂盒说明书操作，用酶标仪测定530 nm处吸光度，按照公式计算细胞外乳酸含量。

1.3.4 细胞增殖能力的检测 按照1.3.1方法处理细胞后，将 3组细胞接种于96孔板中，每孔2×103个，加入100 μL培养基培养96 h，加入10 μL CCK8溶液于37 ℃烘箱中孵育2 h，测量530 nm处的吸光度(A)。细胞增殖率=实验组A/空白对照组A×100%。实验重复3次。

1.3.5 细胞侵袭能力的检测 用无血清的DMEM培养基按照8∶1的比例稀释Matrigel基质胶，然后加入到Transwell上层小室(100 μL)，于细胞培养箱中过夜。移除基质胶，将细胞铺于上层小室中，用含体积分数5%胎牛血清的DMEM培养基600 μL填充小室下层。24 h后，用棉签擦去上层的细胞和基质，将小室放入无水甲醇中固定20 min，结晶紫染色,于400倍镜下观察。选取5个视野拍摄并计数细胞，计算平均数。侵袭率=实验组侵袭细胞数/空白对照组侵袭细胞数。实验重复3次。

1.3.6 细胞迁移能力的检测 将细胞按照1.3.1方法分组培养，板中形成完整的单层细胞后，用200 μL枪头的尖端在底部画一条直线,用PBS清洗，加入2 mL含有体积分数2%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。分别于培养0和24 h后镜下拍照，用Image Pro Plus 6.0分析。划痕愈合率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。迁移率=实验组划痕愈合率/空白对照组划痕愈合率。实验重复3次。

1.4统计学处理应用SPSS 16.0进行统计分析。食管正常及癌组织中MCT4高表达率的比较，不同临床病理特征癌组织中MCT4高表达率的比较采用χ2检验；3种细胞中MCT4表达水平的比较，3组细胞中MCT4表达水平、细胞外乳酸含量的比较采用单因素方差分析；NC-siR组和MCT4-siR组细胞增殖率、迁移率及侵袭率的比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1食管鳞癌组织中MCT4的表达食管鳞癌和正常食管黏膜组织中MCT4的表达见图1。食管鳞癌组织中MCT4高表达率为70.0%(42/60)，而正常食管黏膜组织中为26.3%(5/19)，二者比较差异有统计学意义(χ2=11.427，P<0.001)。不同临床病理特征食管鳞癌组织中MCT4表达的比较见表2。由表2可知，高中分化癌组织中MCT4高表达率低于低分化癌组织。

图1 食管鳞癌(A)和正常食管黏膜(B)组织中MCT4的表达(SP,×200)

例

续表1

2.23种细胞中MCT4蛋白表达水平的比较见图2。Het1-A、EC9706和EC109细胞中MCT4蛋白表达水平分别为(0.52±0.05)、(0.84±0.04)和(0.92±0.03)，3组间差异有统计学意义(F=86.857，P<0.001)；EC9706和EC109细胞中MCT4蛋白表达水平高于Het1-A，且EC109细胞中MCT4蛋白表达水平高于EC9706(P<0.05)，故选取EC109用于后续实验。

图2 3种细胞中MCT4蛋白的表达

2.3下调MCT4后EC109细胞生物学行为的变化

2.3.1 3组细胞中MCT4的表达 见图3、表3。与空白对照组和NC-siR组比较，MCT4-siR组细胞中MCT4蛋白表达水平降低(P<0.05)。

1：空白对照组；2：NC-siR组；3：MCT4-siR组

2.3.2 3组胞外乳酸含量及细胞增殖率、侵袭率、迁移率的比较 图4和表3。可以看出，MCT4-siR组胞外乳酸含量较空白对照组和NC-siR组降低(P<0.05)，细胞增殖率、迁移率和侵袭率均较NC-siR组降低(P<0.001)。

A：空白对照组；B：NC-siR组；C：MCT4-siR组

*:与空白对照组和NC-siR组相比，P<0.05

3 讨论

肿瘤细胞分泌的乳酸在肿瘤微环境中持续大量积累会反馈性抑制肿瘤细胞的能量获取，使细胞外基质和基底膜发生降解，从而导致肿瘤细胞侵袭和迁移能力增强[9]。乳酸还可诱导转化生长因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)的表达，促使肿瘤细胞迁移能力增强[10]。因此，控制乳酸转运的MCT4与肿瘤细胞的生长关系密切[3-4]。张宝月等[11]发现从正常宫颈上皮发展到宫颈癌的过程中，组织中MCT4蛋白表达水平不断增加。也有文献[5]报道在正常食管到巴雷特食管再到食管腺癌发展过程中，组织中MCT4蛋白表达水平呈线性增长。本研究结果显示，食管鳞癌组织中MCT4蛋白的表达水平高于正常食管黏膜组织，且癌组织分化程度越低，MCT4蛋白表达水平越高；食管鳞癌细胞EC9706和EC109中MCT4蛋白表达水平高于正常食管黏膜细胞Het1-A。研究结果提示，肿瘤细胞恶性程度增加，MCT4表达水平也增加，以维持肿瘤细胞正常的能量代谢。

Voss等[12]利用吖啶黄抑制剂破坏MCT4-CD147的连接后，肿瘤细胞增殖能力下降，并在体内观察到肿瘤血管生成受抑。氯汞苯磺酸盐、醋酸铅和二氯化镉均可抑制MCT4与CD147的相互作用，造成乳酸外排减少，但是这些化合物有很大的副作用，暂时还未用于肿瘤治疗[13-14]。

利用siRNA下调口腔鳞癌细胞和肝癌细胞中 MCT4 的表达后，肿瘤细胞的侵袭和转移能力降低[15-16]。运用siRNA沉默尿路上皮癌细胞中的MCT4可造成胞内乳酸的聚集，导致细胞增殖能力下降[17]，这种增殖抑制作用在高度恶性细胞中效果更明显[18]。前列腺癌细胞的糖酵解能力较强，会产生过多的乳酸，特异性抑制前列腺癌细胞中MCT4基因表达后，肿瘤细胞的增殖能力、糖酵解能力和乳酸分泌能力均显著降低[19]。下调宫颈癌Hela和Siha细胞中MCT4的表达，可成功抑制肿瘤细胞的生物学行为[8]。

本实验中我们参考郭振江等[8]设计，合成靶向MCT4的siRNA，转染至EC109细胞后，转染细胞细胞外乳酸含量降低，同时细胞增殖率、迁移率和侵袭率下降；提示沉默MCT4基因可以使EC109细胞的侵袭和迁移能力变弱，其作用机制可能与减少细胞外乳酸含量有关，但是具体机制还需要进一步探索。

综上所述，MCT4在正常食管上皮进展到食管鳞癌过程中发挥了重要作用，下调其表达可以降低食管鳞癌细胞的恶性生物学行为。MCT4很可能会成为一个食管鳞癌临床诊断和分子治疗的靶点。