厄洛替尼联合康莱特对肺癌A549细胞增殖、侵袭及JAK2/STAT3信号通路的影响

江国强，方 芳

武警四川省总队医院呼吸科 四川乐山 614000

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，也是我国因癌症而引起死亡的首要因素；近些年其发病率呈上升和年轻化的趋势，严重威胁人们的健康[1-2]。肺癌的侵袭及转移是临床上治疗的一大难题。厄洛替尼是一种口服的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，可通过对酪氨酸激酶的靶向抑制而阻断增殖信号向细胞核的转导，从而达到抑制细胞增殖的效果；由于厄洛替尼具有良好的安全性及显著的疗效，目前已广泛应用于临床[3-4]。有多项研究[5-6]显示厄洛替尼可联合山奈酚、靶向生存素的siRNA等影响肺癌细胞的增殖、凋亡。康莱特注射液是从中药薏苡仁中提取出来的一种新型的抗肿瘤药物，对胃癌、胰腺癌等多种肿瘤具有抑制和杀伤作用，可有效抑制肿瘤细胞的生长[7-8]。目前关于厄洛替尼和康莱特联合能否产生协同作用治疗肺癌还未可知，因此，作者进行了如下研究，以期为肺癌的治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器康莱特注射液(生产批号：1202141-2)购自浙江康莱特药物有限公司，厄洛替尼购自上海罗氏有限公司(货号:BDX034001C)；RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Invitrogen公司，PVDF膜购自上海罗氏制药有限公司；Matrigel人工基底膜、Transwell侵袭小室均购自美国Corning公司；Ki-67、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、JAK2和磷酸化(磷酸化位点Y1007)JAK2(p-JAK2)、STAT3和磷酸化(磷酸化位点Y705)STAT3(p-STAT3)抗体均购自美国Abcam公司；酶标仪购自美国Biotek公司。

1.2细胞培养人肺癌A549细胞购自上海中科院细胞中心。取出在液氮罐冻存的A549细胞，即刻37 ℃水浴解冻，解冻后细胞在含有体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养基中、于体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中37 ℃培养，每隔2～3 d用胰蛋白酶消化传代。选择对数生长期的细胞用于实验。

1.3各组细胞活力的检测将对数生长期的A549细胞分为对照组(细胞不经特殊处理)、厄洛替尼组(10 mg/L的厄洛替尼处理)[9]、康莱特组(20 mg/L的康莱特处理)[10]和联合组(10 mg/L的厄洛替尼和20 mg/L的康莱特共同处理)。以5×104个/mL的密度(每孔150 μL)接种对数生长期的细胞于96孔板，置于培养箱中培养24 h，按照上述分组处理，每组设5个复孔。分组培养48 h以后，加入20 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液，继续培养4 h，吸出上清，加入150 μL的DMSO溶液，振荡混匀10 min，酶标仪测定吸光度值(波长为490 nm)，以吸光度值反映细胞活力。

1.4各组细胞侵袭能力的检测4 ℃冰箱中将Matrigel基质胶融化，按照1∶6的体积比将融化的基质胶用预冷的无血清培养基稀释。在Transwell小室的上室铺上基质胶100 μL，操作过程中不能产生气泡，并在37 ℃培养箱中3～5 h以待成胶，将残留在小室内的液体吸出，每孔加入100 μL预热的无血清培养基，于37 ℃培养1 h。将对数生长期的A549细胞制备成细胞悬液，按照1.3项分组(每组均设5个复孔)接种。同时在下室每孔加入含血清的培养基500 μL。分组培养48 h，取出小室，棉签轻轻擦掉上室Matrigel胶及未迁移的细胞，室温条件下，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，1 g/L结晶紫染色10 min，磷酸盐缓冲液洗涤后，在200倍显微镜下选择5个视野观察，计数穿膜细胞数，取均值。

1.5各组细胞中Ki-67、E-cadherin、MMP-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达的Western blot检测于各处理组(同1.3项的实验分组)细胞中加入适量的细胞裂解液，BCA法测定总蛋白的浓度。每泳道上样40 μg，SDS-PAGE后转PVDF膜、封闭，加Ki-67、E-cadherin、MMP-2、p-JAK2、p-STAT3抗体(皆按照1∶500稀释)和GAPDH(1∶1 000稀释)抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，加入稀释好的二抗，孵育2 h，取出PVDF膜，加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温条件孵育1.5 h，ECL显色，暗室中显影定影。以目的蛋白和内参条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行分析，应用析因设计的方差分析比较厄洛替尼和康莱特单独或联用对肺癌细胞活力，侵袭能力，Ki-67、E-cadherin蛋白及JAK2/STAT3信号通路蛋白表达的影响，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1厄洛替尼和康莱特单独或联用对A549细胞活力和侵袭能力的影响见表1。由表1可知，厄洛替尼或康莱特单独使用均可抑制A549细胞活力和侵袭能力，二者联用后作用增强。

表1 4组细胞活力、细胞侵袭能力的比较(n=5)

2.2厄洛替尼和康莱特单独或联用对A549细胞Ki-67、E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响见图1、表2。由表2可知，厄洛替尼或康莱特单独使用均可抑制A549细胞Ki-67、MMP-2的表达，增加E-cadherin蛋白的表达，二者联用后该作用增强。

2.3厄洛替尼和康莱特单独或联用对A549细胞JAK2/STAT3信号通路活化的影响见图2、表3。由表3可知，厄洛替尼和康莱特单独使用对A549细胞JAK2和STAT3的表达均无影响，但可抑制p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达；二者联用后作用增强。

1：对照组；2：厄洛替尼组；3：康莱特组；4：联合组

1：对照组；2：厄洛替尼组；3：康莱特组；4：联合组

3 讨论

有研究[11]显示，厄洛替尼可有效阻止EGFR跨膜表达受体酪氨酸激酶磷酸化，从而抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡。康莱特是薏苡仁中的一种天然有效的活性成分，具有抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡、阻滞癌细胞分裂等作用，可有效逆转耐药和调节细胞因子[12-13]。

本研究发现，厄洛替尼和康莱特均能有效抑制A549细胞活力和侵袭能力，两者联用对细胞活力和侵袭能力产生更强的抑制作用，提示厄洛替尼和康莱特可联合用于肺癌的治疗。

肺癌的增殖及侵袭受到多种基因的影响。JAK2/STAT3信号被激活，可通过影响下游相关分子Ki-67、E-cadherin、MMP-2等影响肿瘤的发生发展[14-15]。Ki-67是一个与细胞增殖关系密切的核蛋白，可作为细胞增殖活性的标记物，由于其检测较为准确、理想和可靠，目前已得到广泛应用[16]。E-cadherin为cadherin家族中的一个成员，在肿瘤侵袭、转移等过程中有重要作用，在多种组织中表达下调，上调其表达能有效地抑制肿瘤的侵袭及转移[17-18]。MMP-2为MMP家族中重要的一员，其表达与癌细胞的侵袭有关，MMP-2高表达可促进肺癌细胞的侵袭能力，血清MMP-2表达水平也可作为肺癌预后判断的一个辅助指标[19]。本研究发现，厄洛替尼和康莱特均可降低A549细胞中Ki-67、MMP-2及JAK2/STAT3信号通路p-JAK2和p-STAT3的表达，上调E-cadherin表达，而联用作用更明显。

综上所述，厄洛替尼和康莱特均能抑制肺癌细胞活力及侵袭能力，两者联用效果更强，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。