降低miR-21表达对顺铂耐药A549细胞药物敏感性的影响

张 茂，孙浩言，张 磊

宜宾市第一人民医院药剂科 四川宜宾 644000

肺癌是临床中危害最为严重的恶性肿瘤，具有较高的发病率和病死率[1-2]。有研究[3]显示，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌的85%以上[4]。早期NSCLC多不表现出明显的临床症状，确诊时大多已经到癌症晚期，这也极大地增加了临床治疗难度。目前对NSCLC的治疗常采用以铂类为基础的化疗，但在实际治疗过程中常因多种因素造成患者对顺铂(cisplatin，DDP)耐药，进而导致化疗失败[5]。因此，提高患者对DDP的敏感性是目前临床治疗中急需解决的关键问题。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类保守的内源性非编码单链RNAs，含20～24个核苷酸[6]。有研究[7-8]报道miRNAs参与癌症耐药性产生过程，如miR-223及miR-192在DDP耐药的A549细胞(A549/DDP)中明显高表达，降低miR-223或miR-192的表达可明显改善A549/DDP细胞对DDP的敏感性。miR-21具有致癌作用，可通过抑制靶基因的表达促进细胞的增殖、侵袭和转移，并抑制细胞凋亡[9-10]；有研究[11-12]表明，miR-21异常表达与恶性肿瘤化疗药物耐药性的产生密切相关。本研究分析了miR-21在DDP敏感和耐药NSCLC组织中的表达，并观察降低miR-21的表达对A549/DDP细胞活性和凋亡的影响，探讨miR-21在DDP耐药性产生中的作用，为NSCLC的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1组织标本来源收集宜宾市第一人民医院2016年3月至2017年10月经皮肺穿刺法采集的40例NSCLC患者的活检组织标本，所有患者均未接受过手术治疗且均无吸烟史。将新鲜的活检组织标本置于液氮中保存备用。40例患者中DDP敏感和耐药各20例；敏感患者DDP联合化疗效果明显，预后良好；而耐药患者在化疗后6个月内症状未缓解或出现病情的反复。试验获该医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂miR-21抑制剂(anti-miR-21)及其阴性对照(anti-miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司。A549及A549/DDP购自美国模式培养物保藏所(ATCC细胞库)；新鲜胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培养液购自上海玉博生物科技有限公司；MTT购自美国Sigma公司；脂质体2000购自美国Invitrogen 公司；Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司；Caspase-3活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；反转录试剂盒购自广州复能基因有限公司。

1.3细胞培养和转染用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养A549、A549/DDP细胞。细胞生长到对数期时，挑取生长状态良好的细胞，以1×105个/孔的密度接种于6孔板中。继续培养至细胞融合度达70%～80%时，按照脂质体2000转染试剂说明书操作，分别将anti-miR-21及anti-miR-NC转染入A549/DDP细胞中，48 h后检测miR-21的表达。

1.4miR-21的qRT-PCR检测取组织标本，A549、A549/DDP、转染anti-miR-21或anti-miR-NC的A549/DDP细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA，按照试剂盒说明书操作反转录成互补的cDNA，行PCR扩增。PCR反应体系：SYBR Ex Taq (2×) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火35 s，重复40个循环。采用2-ΔΔCt法进行定量分析。以U6作为内参。miR-21上游引物序列：5’-ACACTCCAGGTGGGTAGCTTAT CAG-3’，下游引物序列：5’-CAACTGGTGTCGTG GAGTTCG-3’；U6上游引物序列：5’-TGCGGGT GCTCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。细胞实验重复3次。

1.5DDP对转染的A549/DDP细胞半数抑制浓度(IC50)的测定将两组A549/DDP细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL不同浓度(0、30、60、90、120 mg/L)的DDP培养48 h。然后加入5 g/L 的MTT 20 μL继续培养4 h，测定490 nm处的吸光度(A)。生长抑制率=(1-加药组A/对照组A)×100%。以最小二乘法拟合标准曲线，求得IC50。实验重复3次。

1.6两组转染的A549/DDP细胞增殖活性的检测将两组A549/DDP细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，分别于培养0、24、48、72 h后，加入5 g/L的MTT 20 μL继续培养4 h，利用酶标仪测定490 nm处的A值。实验重复3次。

1.7两组转染的A549/DDP细胞凋亡的检测将两组A549/DDP细胞以3×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养48 h后，行Annexin V-FITC/PI双染，避光放置10 min，上流式细胞仪测定凋亡率。实验重复3次。

1.8两组转染的A549/DDP细胞中Caspase-3活性的检测将两组A549/DDP细胞接种于6孔板中培养48 h，按Caspase-3活性检测试剂盒说明书操作，测定405 nm处的A值。实验重复3次。

1.9统计学处理采用SPSS 20.0进行分析，应用两独立样本的t检验比较DDP敏感和耐药患者癌组织中，A549和A549/DDP细胞中miR-21表达的差异，以及两组转染的A549/DDP细胞IC50(DDP)增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1DDP敏感和耐药患者癌组织中miR-21表达的比较miR-21在DDP耐药患者癌组织中的相对表达量(4.56±0.49)高于DDP敏感患者(1.03±0.39)(t=25.208，P<0.001)。

2.2A549和A549/DDP细胞中miR-21表达的比较miR-21在A549/DDP中的表达水平(3.45±0.36)高于A549细胞(1.02±0.27)(t=24.150，P<0.01)。

2.3两组转染的A549/DDP细胞IC50、增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的比较见表1。由表1可知，与anti-miR-NC转染的A549/DDP细胞比较，DDP对anti-miR-21转染的A549/DDP的IC50降低，细胞增殖活性降低，凋亡率和Caspase-3活性升高。

表1 两组转染的A549/DDP细胞IC50、增殖活性、凋亡率和Caspase-3活性的比较(n=3)

3 讨论

miRNAs是一类保守的单链非编码RNAs，在肿瘤的发生发展中起着重要作用，可通过诱导靶基因的降解调控靶基因参与的信号通路，进而影响癌细胞的增殖、侵袭和凋亡等过程[13]。不同肿瘤组织中miRNAs的表达有显著差异，这些具有肿瘤特异性的miRNA可作为肿瘤早期诊断及个性化治疗的新型生物学分子标志物[14]。有研究[15-16]证实miRNA的异常表达与肺癌的发生及化疗药物耐药密切相关，而化疗药物耐药是临床治疗失败的主要原因。因此，研究miRNAs对肺癌耐药性的影响及可能机制，能够为改善肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，提高治疗效果提供依据。

miR-21是一种具有癌基因作用的功能性miRNA。miR-21可通过靶向抑制肿瘤抑制蛋白PDCD4促进乳腺癌的发生发展[17]；miR-21可通过靶向抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)、人类错配修复基因2(hMSH2)，促进NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，并抑制其凋亡[18-19]。除此之外，miR-21还可通过调控抗肿瘤药物的耐药性影响疗效。在耐受性乳腺癌异种移植体中注射miR-21反义寡核苷酸抑制miR-21的表达可改善乳腺癌对曲妥珠单抗的敏感性[20]。降低miR-21表达可抑制低氧诱导因子1(HIF-1)的表达，提高卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性[20]。本研究发现miR-21在DDP耐药的NSCLC组织和A549/DDP细胞中的表达明显高于敏感组织和A549细胞；抑制A549/DDP细胞miR-21的表达可降低DDP对细胞的IC50，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，提高耐药细胞对DDP的敏感性。

综上所述，miR-21有可能成为改善NSCLC患者DDP治疗的疗效及预后的新型的作用靶点。