HPV感染患者阴道灌洗液人防御素5、人防御素2浓度测定

陈 飞，任琛琛，杨 立，张小安，刘 灵，贺 雯，王朝昕，魏心怡，潘雪景

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052

宫颈癌(cervical cancer, CC)居女性常见恶性肿瘤的第2位，高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌及癌前病变的主要病因[1]。在HPV感染初期，HPV DNA以游离形式存在，不导致细胞高级别病变；在HPV持续感染中，HPV DNA与宿主DNA发生整合并转录产生E6/E7 mRNA[2]，因此E6/E7 mRNA不仅仅代表HPV持续感染，还可在一定程度上反映病变活跃程度[3]。

防御素是天然免疫系统的有效成分。人类表达α-防御素和β-防御素两种防御素，已证实它们对包膜病毒和非包膜病毒都有抗病毒活性[4]。人类表达6种α防御素，多达31种β防御素[5]。HD-5是α-防御素的一种，在小肠的特殊上皮Paneth细胞及女性生殖系统的上皮细胞中均有表达[6]。HBD-2是β防御素的一种，已知在泌尿生殖系统上皮细胞中表达[7]。本研究旨在探讨两种防御素与HPV感染的关系，希望能为宫颈癌的治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2017年10月至2018年3月在河南省内各区精准扶贫项目期间发现的HPV感染患者60例，同时纳入同期筛查HPV阴性的妇女11例，均自愿接受宫颈脱落细胞HPV E6/E7 mRNA检查，并收集阴道灌洗液。患者入选标准：既往接受HPV检查，年龄20～75 岁，目前无妊娠，无生殖系统炎症，无激素药物使用史，无宫颈手术史，无全子宫切除手术史，未接受过盆腔放射治疗或其他相关治疗。

1.2流行病学问卷调查所有研究对象均需签署知情同意书以及接受流行病学问卷调查，调查问卷自行设计，调查内容包括患者的一般情况如年龄、初次性生活年龄、孕次及年次等。

1.3HPV E6/E7mRNA检测所有研究对象均在非月经期采样，采样前3 d停止使用阴道栓剂，前1 d禁止性生活。以窥阴器暴露宫颈，擦净宫颈口分泌物，用宫颈刷细心收集宫颈管和宫颈口的脱落上皮细胞，并将标本置入盛有保存液的小瓶内。4 ℃保存，2周内检测。将薄层液基细胞学标本作为HPV E6/E7 mRNA检测标本来源，由技术员使用豪洛捷医疗科技有限公司生产的Aptima HPV HR试剂盒及Aptima HPV 16、18/45分型检测试剂盒，采用转录介导的等温扩增技术定性检测14种高危型HPV E6/E7 mRNA，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型，本研究定性检测高危型HPV 16、18/45型，分析物信号与阈值之比≥0.50为阳性。本研究将HPV E6/E7 mRNA作为HPV持续感染的分组依据。研究对象依据HPV E6/E7 mRNA检测结果分为3组，HPV持续感染组(n=30)、HPV一过性感染组(n=30)、阴性对照组(n=11)。

1.4HD-5、HBD-2检测取阴道灌洗液标本，用HD-5 ELISA 检测试剂盒及HBD-2 ELISA 检测试剂盒(武汉优尔生商贸有限公司)，按试剂盒要求进行检测，每份标本均测3 孔，每次测定均设阳性和阴性对照，以阴性对照孔调零，测量450 nm波长下各孔的吸光度。绘制标准品标准曲线，计算HBD-2和HD-5浓度。

1.5统计学处理应用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较3组间一般情况及阴道灌洗液中HD-5、HBD-2水平的差异，组间两两比较采用LSD-t检验，采用χ2检验比较2 HPV感染组患者HPV感染情况的差异，Cut-off 值采用ROC曲线确定，检验水准α=0.05。

2 结果

2.13组一般情况比较结果见表1。

表1 3组一般情况比较

2.2HPV持续感染组和HPV一过性感染组HPV感染情况见表2。

表2 HPV持续感染组和HPV一过性感染组HPV感染情况 例(%)

2.33组阴道灌洗液中HD-5和HBD-2水平比较与阴性对照组相比，HPV持续感染组与HPV一过性感染组阴道灌洗液中HD-5、HBD-2水平均升高，但2 HPV感染组间差异无统计学意义，见表3。

表3 3组阴道灌洗液中HD-5和HBD-2水平比较 ng/L

*:与阴性对照组相比，P<0.05

2.4HD-5及HBD-2诊断HPV感染的效能HD-5曲线下面积为0.762，HD-5浓度最佳临界值为37.54 ng/L，其在ROC曲线中对应的敏感度为58.3%，特异度为100%。HBD-2曲线下面积为0.775，HBD-2浓度最佳临界值为458.5 ng/L，其在ROC曲线中对应的敏感度为53.3%，特异度为82.0%。

3 讨论

3.1HPV E6/E7mRNA检测在HPV筛查中的意义已有研究[8-9]表明高危型HPV持续感染是癌前病变及宫颈癌的主要病因。HPV感染致癌需经历HPV DNA整合至宿主细胞DNA,转录为HPV E6/E7 mRNA，翻译为HPV E6/E7蛋白最终致癌的过程。在高危型HPV感染中，有90%的感染在2 a内清除，只有10%的感染持续超过3 a，仅5%的高危型HPV感染在3 a内发展为宫颈高级别上皮内瘤变[10]。目前在 HPV 筛查方法中，HPV DNA检测敏感性高但特异性较低， 薄层液基细胞检测特异性较高但敏感性低。HPV DNA阳性只说明HPV“感染”，易造成患者心理压力，并产生过度治疗。与HPV DNA比较，HPV E6/E7 mRNA检测敏感性相同，特异性显著提高(20%～40%)，减少一过性HPV感染的检出，减少不必要的阴道镜转诊，减轻了患者不必要的心理压力。因此本研究采用HPV E6/E7 mRNA作为筛查方法对HPV感染患者进行分组。

3.2HD-5在HPV感染中的意义HD-5是一种富含半胱氨酸的小肽， 在女性生殖道的多个上皮细胞内表达并分泌，在宫颈阴道灌洗液中也检测到HD-5的存在[6]。在对HPV假病毒的研究中发现人HD-5能阻断人皮肤和黏膜HPV的感染[11]，对宫颈癌的主要病因HPV感染有抑制作用，但其具体机制尚不明确。Wiens等[12]研究发现HD-5抑制HPV 16感染的可能机制是防御素与病毒衣壳直接结合所致，同时证实了HD-5在细胞表面与HPV 16共存时效果最好。本研究结果显示，与阴性对照组相比，HPV持续感染组与HPV一过性感染组阴道灌洗液HD-5水平升高，但两HPV感染组间差异无统计学意义，证实了防御素可能在HPV感染早期发挥作用，与Buck等[13]的研究HD-5在HPV感染早期及转录前发挥作用的结论一致。同时，进一步作ROC曲线，明确HD-5诊断HPV感染的效能，结果显示HD-5浓度取37.54 μg/L时其诊断准确性最高，敏感度为58.3%，特异度为100%。

3.3HBD-2在HPV感染中意义HBD-2最初于1997从银屑病皮损中分离出来，对革兰阴性菌的杀灭效果最好。近年来有关HBD-2在HPV感染中的作用正逐步受到关注。宫颈癌相关研究[14]提示HBD-2在宫颈癌早期表达增加，同时提出HBD-2的表达可以作为宫颈肿瘤的辅助诊断标准，但具体在宫颈癌发展的哪个节点起作用并不明确。另外，在皮肤HPV感染如尖锐湿疣及外阴疣中HBD-2的表达也增加[15]。本研究结果显示，HPV感染患者阴道灌洗液HBD-2的水平升高，但在HPV一过性和持续性感染患者中差异无统计学意义，提示HBD-2可能在HPV感染早期发挥作用，但对其机制仍需进一步探究。此外，研究还发现HBD-2 mRNA在HPV感染的其他病种如复发性呼吸性乳头状瘤病患者的乳头状瘤组织中的表达升高[7]。以上均表明，HBD-2可能具有抗HPV感染的作用。进一步作ROC曲线，明确HBD-2诊断HPV感染的效能，结果显示HBD-2浓度取458.5 ng/L时其准确性最高，敏感度为58.3%，特异度为100%。

综上所述，HD-5及HBD-2在HPV感染早期起关键作用，可作为宫颈肿瘤的辅助诊断标准。