洛索洛芬钠对急性痛风性关节炎大鼠血清IL-1β和滑膜组织中NF-κB蛋白表达的影响

江 丹，熊金河，尚 华

遂宁市中心医院风湿免疫科 四川遂宁 629000

急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis，AGA)是因嘌呤代谢紊乱与尿酸代谢异常引起的一种疾病[1]，发病率逐年攀升[2]。AGA是一种临床较为常见的软组织损伤慢性炎症性疾病，具有迁延不愈、反复发作的特点，若不及时治疗会引起脏器功能障碍而严重降低生活质量[2-3]。洛索洛芬钠属于临床常用的非甾体类抗炎药，在减轻AGA引发的疼痛和炎症时效果明显[4]。通过前期研究[5]，本课题组发现洛索洛芬钠治疗AGA有显著的效果。核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)在调控宿主的炎症中发挥重要的作用[6-9]。本实通过采用向膝关节注射尿酸钠的方法来建立AGA大鼠模型，观察洛索洛芬钠对AGA大鼠IL-1β和NF-κB表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器洛索洛芬钠片(迪沙药业集团有限公司，国药准字：H20050437)；秋水仙碱片(云南植物药业有限公司，国药准字：H53020166)；尿酸购自美国Sigma公司；IL-1β ELISA检测试剂盒购自美国Abcam公司。凝胶成像系统由美国GE公司提供；ELx800酶标仪(美国BioTek公司产品)；伯乐小型垂直电泳仪及电泳槽、伯乐全能型蛋白快速转膜仪(美国Bio-Rad公司产品)。

1.2尿酸钠溶液的制备尿酸2 g加入400 mL水(100 ℃) 中，再用氢氧化钠溶液调pH至7.4。自然冷却至25 ℃。搅拌后4 ℃冷藏过夜。过滤析出的絮状沉淀，得到微晶型尿酸钠，80 ℃干燥。称量1 g尿酸钠，研磨后加入20 mL无菌生理盐水，获得50 g/L尿酸钠混悬液。

1.3实验分组与模型建立雄性清洁级6～8周龄SD大鼠50只，体重210～250 g，购自四川大学的实验动物中心。大鼠在无菌消毒、室温25～27 ℃、湿度45%的安静空间中饲养，饮用消毒过的水，保证大鼠身体健康无营养不良及其他疾病。将50只大鼠分为：正常组(n=12)、模型组(n=12)、治疗组(n=13)，阳性对照组(n=13)。除正常组外均建立AGA模型：大鼠仰卧，清洁膝关节的皮毛。膝关节内注入尿酸钠，诱导急性关节炎。模型组、治疗组、阳性对照组大鼠每个关节注射0.2 mL尿酸钠悬液，正常组注射等量生理盐水。随后治疗组大鼠给予0.3 mg/kg洛索洛芬钠，阳性对照组给予0.3 mg/kg秋水仙碱，均混合10 mL温开水灌胃，其余两组给予生理盐水。灌胃时间为每天8：00，1次/d，连续7 d。

1.4关节肿胀度测定测量实验动物关节直径并记录，由专人完成，时间点分别为造模前、造模完成后的1、2、4、6、8、24 h。每次测量3次，获取3个数值，取其平均值记录。建模后取不同时间点测量数值，将其与建模前的数值相减，所获取数值为关节肿胀度。

1.5步态分级与评分建立实验动物模型24 h后对其行走步态进行观察，并对其进行分级。其中0级为正常状态，评为0分；1级可见下肢弯曲，程度不重，评为1分；2级较前者为重，行走时可接触地面，但已见下肢明显异常，评为2分；3级跛行十分明显，行走时下肢已不接触地面，评为3分。

1.6IL-1β的水平检测于建模24 h后进行。水合氯醛麻醉实验动物。大鼠仰卧，固定四肢，充分暴露腹部。将腹部剪开，寻找到腹主动脉，进行穿刺，获取血液标本，室温下静置1 h。3 000 r/min离心15 min，吸取上清，应用ELISA试剂盒进行检测。

1.7Western blot法检测滑膜组织中NF-κB的蛋白表达处死实验动物，分离出膝关节滑膜组织，放入干净研磨器于冰上操作。加入RIPA裂解液研磨后获取匀浆，提取总蛋白。每孔上样50 μg蛋白，上样前加入等体积2×Loading buffer煮沸5 min，设置积层胶中90 V电压电泳，分离胶中120 V电压电泳，电泳2.5 h。将蛋白在200 mA恒流条件下转移到PVDF膜上，经体积分数5%牛血清白蛋白室温封闭120 min后，加1∶600稀释后的一抗于4 ℃条件下孵育10 h，加1∶2 000稀释后的二抗在室温中孵育约2 h。用ECL发光试剂盒发光后显影。以Quantity One软件分析NF-κB、β-actin条带的灰度值，NF-κB蛋白表达水平=NF-κB条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.8HE染色取大鼠膝关节滑膜组织石蜡包埋，4 μm厚切片，放置在经过防脱片处理的干净载玻片上，置恒温箱中50 min，二甲苯脱蜡。乙醇水洗后苏木精处理5 min；蒸馏水冲洗切片10 min。应用体积分数0.5%～1.0%盐酸乙醇分化， 3～5 s(蓝色至红色)，冲洗10 min。伊红染色20 s，蒸馏水冲洗10 min。使用梯度乙醇脱水，二甲苯至透明，中性树胶封片，高倍显微镜下观察。

1.9统计学处理应用SPSS 22.0分析。各组各时间点AGA大鼠膝关节肿胀程度比较行重复测量数据的方差分析，各组大鼠血清IL-1β水平和滑膜组织中NF-κB蛋白表达的比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠不同时间点膝关节肿胀程度比较结果见表1。

表1 各组大鼠不同时间点膝关节肿胀程度比较

F组间=138.895，F时间=497.746，F交互=15.612，P均<0.001

2.2各组大鼠步态变化除正常组外，其他各组大鼠活动受到影响，肢体发生变形，关节肿胀显著，行走时明显异常，甚至离开地面，其中模型组最为明显。模型组、治疗组、阳性对照组大鼠步态评分分别为(2.96±0.33)、(1.38±0.24)、(1.25±0.32)分，3组比较差异有统计学意义(F=260.740，P<0.001)，其他两组评分较模型组降低 (P<0.05)。

2.3各组大鼠血清中IL-1β水平和各组大鼠滑膜组织中NF-κB蛋白的表达的比较结果见图1和表2。

1～4：分别为正常组、模型组、治疗组和阳性对照组

组别IL-1βNF-κB正常组17.82±4.110.23±0.07模型组45.21±7.65∗0.91±0.30∗治疗组21.11±3.56∗#0.60±0.20∗#阳性对照组20.13±4.78∗#0.54±0.18∗#F72.12322.241P<0.001<0.001

*：与正常组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05

2.4各组AGA大鼠的病理变化见图2。正常组关节滑膜组织周围软组织、关节、滑膜和软骨细胞正常，无炎性细胞，无增生。模型组尿酸盐结晶沉积、炎性细胞浸润，排列不规则，成纤维细胞及滑膜出现增生，组织出现坏死且有炎性渗出。治疗组和阳性对照组上述改变较模型组明显减轻。

A:正常组；B:模型组；C:治疗组；D:阳性对照组

3 讨论

AGA的发病主要是由于尿酸钠结晶在关节及其周围淤积所致，从而引起炎症级联反应，导致一些促炎细胞因子和中性粒细胞聚集[10-11]。NF-κB信号通路是一种普遍存在于所有细胞中的重要核转录因子之一，在细胞黏附、免疫和炎症反应中起着中心介质的作用[12]。在AGA发病过程中，激活NF-κB信号通路导致体内的炎性细胞因子在细胞核内不断地产生和释放，炎症反应不断加重[13]。

洛索洛芬钠是临床常用的非甾体类抗炎药。本文研究结果提示洛索洛芬钠能够缓解AGA所导致的大鼠膝关节肿胀、改善模型大鼠的步态变化。本研究结果显示，AGA模型组血清中IL-1β含量升高，治疗组与阳性对照组血清中IL-1β含量均降低；模型组滑膜组织中NF-κB蛋白表达增高，治疗组与阳性对照组降低。以上结果提示洛索洛芬钠可能抑制了严重骨破坏的进展。

综上所述，洛索洛芬钠对大鼠急性痛风性关节炎具有一定的改善作用，其机制与抑制NF-κB信号通路有关。