葡萄砧木杂种的耐碱性鉴定

张星，张剑侠*

（西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨凌 712100）

土壤盐碱化是影响世界农业生产最主要的非生物胁迫之一，已成为限制农作物生长的一个主要因素[1]。我国是盐碱地大国，土地盐碱化总面积约为3630万 hm2，并有持续扩大的趋势[2]。我国盐碱地大部分分布在北方干旱、半干旱和半湿润地区，盐碱胁迫会降低土壤渗透势、导致离子失衡，进而抑制植物生长，降低作物的品质和产量，严重地区甚至会导致植物死亡，盐碱胁迫已经成为制约果树产业发展的重要因素[3]。

葡萄属于非盐生植物，但相比其它北方落叶果树而言，其耐盐碱极限较大且耐盐碱能力依品种、砧木、树龄、生长期的不同而不同[4]。随着我国葡萄种植范围的扩大以及区域化栽培的需要，在利用嫁接栽培时，对砧木和接穗品种进行试验[5]，筛选出具有不同抗性且与接穗亲和性良好的砧木品种，是我国葡萄生产发展的迫切需要[6]。

本试验以课题组自主选育的4个葡萄砧木组合的杂种优株作为试验材料，采用浇灌浓度为0.5 mol/L NaHCO3与Na2CO3（1∶1）的混合盐溶液（pH8.5）来模拟碱胁迫环境，观察记录不同株系的黄化程度并进行碱害严重度分级，同时测定叶片的相关生理指标并利用隶属函数法进行评价，以碱害严重度作为主指标，参考3项生理指标的平均隶属函数值，对不同材料进行耐碱性评价，以筛选出耐碱性强的杂种优株，为选育多抗性砧木新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为西北农林科技大学葡萄种质资源圃中保存的4个砧木杂交组合的32个杂种优株。具体组合为：河岸葡萄（♀）（V. riparia）×山葡萄左山75097（V.amurensis）12个优株；山葡萄泰山-11（V. amurensis）×河岸-2（V. riparia Mcadams）3个优株；山葡萄泰山-11（V. amurensis）×沙地葡萄（V. rupestris）3个优株；5BB（V. berlandieri×V. riparia）×山葡萄黑龙江实生（V. amurensis）14个优株。以砧木品种‘5BB’作为耐碱对照（CK1），欧洲葡萄品种‘红地球’作为不耐碱对照（CK2）。

1.2 试验方法

1.2.1 材料准备

2018年6月初对试验材料进行盆中压条繁殖。营养土配置按照园土∶蛭石∶有机肥=5∶1∶0.5的比例，混合均匀后装入内径33 cm的花盆中，每盆装营养土10 kg。将装有营养土的花盆搬至试验树下，先将花盆中的土倒出一半，选择母树上生长较长的一年生绿枝，摘去刚好没入花盆中部位所生长的叶片，用小刀在韧皮部轻轻划两下，然后埋入土中，覆土并浇灌0.1 mg/L的IBA溶液，以促进生根，最后将另一半土覆上，之后定时浇水、除草、松表土，每杂种（品种）压条繁殖4盆。8月中旬剪离母株，9月中旬每杂种（品种）各选择生长健壮的2株盆栽苗搬入大棚中进行碱胁迫试验。

1.2.2 试验处理

2018年9月上旬预备试验，参照ZHANG等[7]对苹果砧木水培碱胁迫用摩尔比为1∶1的浓度为1 mol/L的Na2CO3与NaHCO3混合液的方法，对上一年葡萄砧木杂种及对照品种‘5BB’‘红地球’的盆栽植株共56份材料在大棚中进行碱胁迫处理。结果显示，该浓度下3 d后约1/4的盆栽植株死亡，表明该浓度偏高，不适合于葡萄耐碱性评价。

9月中旬对当年压条繁殖的32个杂种优株盆栽苗，采用摩尔比为1∶1的浓度为0.5 mol/L的Na2CO3与NaHCO3混合液（pH8.5）进行浇灌，模拟碱胁迫处理，每盆浇灌混合液800 mL，每5 d浇灌一次，共浇灌两次。每个试验材料处理设置1个处理组，1个对照组，对照为清水浇灌。进行为期10 d的碱胁迫，并在处理当天、5 d、10 d后记录碱害严重度并测定相应生理指标。

1.2.3 指标测定

电导率的测定采用电导仪法[8]；叶绿素的测定采用直接浸提法[9]；丙二醛测定采用硫代巴比妥酸法[10]。

根据碱害分级标准[11-12]进行碱害分级，碱害分级标准为：

0级—生长正常，无碱害症状；

1级—轻度碱害，有少部分叶片出现失绿斑；

2级—中度碱害，大部分叶片出现失绿斑；

3级—重度碱害，大部分叶片黄化；

4级—极重度碱害，叶片黄化发白、叶落。

1.2.4 数据分析

采用隶属函数法进行耐碱性综合评价[13]，其公式为：

式中：Uij表示i种类j指标的抗寒隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmin表示所有种类j指标的最小值；Xjmax表示所有种类j指标的最大值；i表示某个品种；j表示某项指标。

根据公式计算出隶属函数值，再用每株系的生理指标隶属函数值的平均数作为其平均隶属度。按照平均隶属度（Subordinate level，SL）将耐碱性分为5级：0.70～1.00为高耐碱（HR），1级；0.50～0.69为耐碱（R），2级；0.40～0.49为中等耐碱（MR），3级；0.30～0.39为不耐碱（S），4级；0～0.29为极不耐碱（HS），5级。

生理指标采用SPSS 25.0软件分析，采用Duncan's法进行平均数多重比较。

1.2.5 耐碱性分级

以碱害严重度作为主指标，参考3项生理指标的平均隶属函数值，将葡萄的耐碱性分为5个类型：高耐碱类型、耐碱类型、中等耐碱类型、不耐碱类型、极不耐碱类型。

2 结果与分析

不同的碱害等级，从表观水平上反映了各株系不同的耐碱水平。由表1可知，根据胁迫10 d碱害程度分级，‘HS-2’‘HS-5’‘HS-6’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-11’‘HS-12’‘TH-2’‘TH-3’‘BBS-1’‘BBS-4’‘BBS-5’‘BBS-10’‘BBS-15’‘5BB’仅表现为轻微受碱胁迫症状，碱害等级为1级；‘HS-1’‘HS-3’‘TH-1’‘BBS-13’‘红地球’大部分叶片出现失绿斑，碱害等级为2级；‘HS-4’‘HS-7’‘TS-1’‘TS-3’‘BBS-2’‘BBS-3’‘BBS-11’大部分叶片出现黄化，碱害等级为3级；‘HS-10’‘TS-6’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-12’受到极重度碱害，叶片黄化脱落甚至死亡，碱害等级达到4级。

表1 各砧木杂种优株碱害程度分级Table 1 The class of alkali injury of different grape rootstock hybrids

由表2可知，不同砧木杂交后代的叶绿素含量在碱胁迫下变化趋势不同，叶绿素含量的变化趋势分为3种，‘HS-1’‘HS-5’‘HS-11’‘BBS-1’‘5BB’‘红地球’的叶绿素含量先增加后减少，‘HS-6’‘HS-7’‘HS-12’‘TH-1’‘TH-2’‘BBS-4’‘BBS-10’‘BBS-13’的叶绿素含量先减少后增加，其余株系叶绿素含量一直减少，‘HS-7’‘HS-12’‘TH-3’‘BBS-5’‘5BB’的叶绿素在10 d的含量大于胁迫初期，且‘5 B B’含量增加最大，增幅达到21%。叶绿素含量下降幅度最大的是‘HS-3’，降幅达到69.6%，其余株系下降幅度在4%～69.1%，表明不同葡萄砧木杂种优株对碱胁迫的响应方式不同。表中，部分株系如‘HS-10’‘TS-6’‘BBS-2’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-11’‘BBS-12’在试验结束之前便已叶落干枯，无法测定其叶绿素含量，也从侧面反映其耐碱性较差。

由表3可知，胁迫10 d与胁迫初期相比，4个组合叶绿素含量均出现显著性下降。其中，TS组合下降比例最高，为46.1%；TH组合下降比例最低，为17.4%；BBS与HS组合下降比例分别为33.3%与23.8%。胁迫10 d与5 d相比，TH组合叶绿素含量显著性下降27.2%，其余各组合叶绿素含量无显著变化。

表2 各砧木杂种优株叶绿素（Chl）含量变化Table 2 Changes of chlorophyll content of different grape rootstock hybrids under alkali stress (Unit: mg/g FW)

表3 各杂交组合叶绿素含量变化显著性分析Table 3 Signi fi cant analysis of chlorophyll content of different cross combinations

由表4可知，各个株系的叶片相对电导率值变化趋势基本相同，除极个别株系如‘HS-1’先升后降，‘BBS-4’先降后升之外，其余株系均随着胁迫时间的延长而增加，且增加幅度因植株耐碱性的强弱而表现出较大差异。在碱胁迫10 d时，相对电导率值最小的是‘HS-11’，为30.0%；最大的是‘BBS-1’，为63%。其余株系电导率在32%～59%。与胁迫初期相比，‘HS-3’与‘HS-6’的相对电导率增加值最大，分别增加了3.76倍与3.19倍，其它株系如‘HS-2’‘HS-5’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-12’‘TS-3’的电导率增加值也均在100%以上，增加值最小的是‘红地球’和‘BBS-15’，分别只增加了15%和16%。胁迫末期部分株系因耐碱性差，达到极重度碱害而无法采样对电导率值进行测定，其中，‘BBS-7’‘BBS-8’在5 d时电导率值已经达到90%以上，说明其极不耐碱。

由表5分析可知，胁迫10 d与胁迫初期相比，各组合相对电导率值都出现显著性上升，其中HS组合上升125%，上升比例最高，BBS组合上升23.2%，上升比例最低，TH和TS组合分别上升了38.5%和40.4%。胁迫10 d与5 d相比，HS、TH与BBS组合相对电导率值分别显著性上升30.3%、14.9%、17.8%，TS组合变化不显著。

植物在逆境条件下通常会发生活性氧的积累，发生膜脂化作用，丙二醛（MDA）便是其主要产物之一，通常将其作为膜脂过氧化程度的指标，表示植物对逆境条件反应的强弱。由表6可知，碱胁迫条件下不同株系MDA含量随时间的延长均不断增加，MDA增加幅度因株系间自身差异而有较大区别，碱胁迫10 d时，MDA含量最高的是‘TS-3’，达到11.35 mmol/g；MDA含量最低的是‘HS-12’，为8.21 mmol/g。与胁迫初期相比，MDA增量最大的是‘HS-4’，增加了8.82 mmol/g；增量最小的是‘BBS-5’，为2.36 mmol/g。其余株系的MDA增量介于2.70～7.27 mmol/g，MDA增量的不同，反映了各株系在碱胁迫下受到的伤害不同。

表4 各砧木杂种优株相对电导率（REC）变化Table 4 Changes of relative electrical conductivity of different grape rootstock hybrids under alkali stress

表5 各杂交组合电导率变化显著性分析Table 5 Signi fi cant analysis of REC of different cross combinations

由表7分析可知，胁迫10 d与胁迫初期相比，各组合MDA含量均出现显著性上升，其中HS组合上升194%，上升比例最高；TH组合上升50.3%，上升比例最低；TS和BBS组合分别上升115%和71.8%。胁迫10 d和5 d相比，HS、TS与BBS组合MDA含量分别显著性上升26.5%、48.0%、17.8%，TH组合变化不显著。

由表8可以看出，通过隶属函数法对碱胁迫10 d的各项指标进行综合性评价后，各株系耐碱性分为高耐碱、耐碱、中等耐碱、不耐碱与极不耐碱5种类型，‘HS-5’‘5BB’(CK1)属于高耐碱类型；‘HS-1’‘HS-2’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-11’‘HS-12’‘TH-2’‘BBS-1’‘BBS-4’‘BBS-5’‘BBS-10’‘BBS-13’‘BBS-15’属于耐碱类型；‘HS-3’‘HS-6’‘TH-1’‘TH-3’‘红地球’（CK2）属于中等耐碱类型；‘HS-4’‘HS-7’‘TS-1’‘BBS-3’属于不耐碱类型；‘HS-10’‘TS-3’‘TS-6’‘BBS-2’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-11’‘BBS-12’属于极不耐碱类型。

表6 各砧木杂种丙二醛（MDA）含量变化Table 6 Changes of MDA content of different grape rootstock hybrids under alkali stress (Unit: mmol/g FW)

表7 各杂交组合丙二醛（MDA）含量变化显著性分析Table 7 Signi fi cant analysis of MDA content of different cross combinations

总体上，各供试材料表型与3项生理指标的平均隶属函数值的评价结果相一致，有个别杂种2种方法评价结果略有差异。因此，以碱害严重度作为主指标，参考3项生理指标的平均隶属函数值，将供试材料的耐碱性分为5种类型：‘HS-5’‘5BB’属于高耐碱类型；‘HS-1’‘HS-2’‘HS-6’‘HS-8’‘HS-9’‘HS-11’‘HS-12’‘TH-2’‘TH-3’‘BBS-1’‘BBS-4’‘BBS-5’‘BBS-10’‘BBS-15’属于耐碱类型；‘HS-3’‘TH-1’‘BBS-13’‘红地球’属于中等耐碱类型；‘HS-4’‘HS-7’‘TS-1’‘TS-3’‘BBS-2’‘BBS-3’‘BBS-11’属于不耐碱类型；‘HS-10’‘TS-6’‘BBS-6’‘BBS-7’‘BBS-8’‘BBS-9’‘BBS-12’属于极不耐碱类型。

表8 胁迫10 d各砧木杂种优株耐碱性平均隶属值与耐碱水平Table 8 Subordinative level of alkali stress of different grape rootstock hybrids on 10 days

3 讨论与结论

盐碱胁迫会影响植物的生长和代谢等诸多方面，对光合作用的影响尤为突出[14]。盐碱胁迫下，植物细胞中积累的Na+、Cl-使叶绿体类囊体膜糖脂和不饱和脂肪酸含量下降，饱和脂肪酸含量上升，导致膜的光合特性受到破坏，而叶绿素为类囊体膜上色素蛋白复合体的重要成分，这样导致叶绿素含量降低，进而影响植物光合作用的积累[15]。晋学娟等[16]研究表明，不同盐碱胁迫条件下，随着培养时间的延长，红地球/贝达嫁接苗叶片的叶绿素呈下降趋势。付晴晴等[14]通过对各葡萄株系进行盐碱胁迫，得出各葡萄株系叶片叶绿素含量以及净光合速率（Pn）表现出不同程度的降低，且耐盐性较好株系下降幅度明显小于盐敏感株系。本试验中，有部分株系出现胁迫末期叶绿素含量大于胁迫初期的情况，这在前人的研究中也有类似结果[17]，说明不同葡萄砧木材料对碱胁迫不同的适应过程以及在碱胁迫下不同的耐碱机制。

细胞膜是细胞体与外界发生物质运输和交换的重要通道，同时也是对环境胁迫最为敏感的部位。因此，植物细胞膜透性是研究植物抗性的一个重要生理指标[18]，当植物受到逆境伤害时，膜脂首先受到伤害，造成细胞膜透性的变化[19]。盐碱环境下，碱胁迫通过影响细胞膜的膜脂和膜蛋白，增大细胞膜脂的透性和提高膜脂过氧化的速度，进而使细胞膜的正常生理功能遭到破坏[20]。细胞膜受伤害之后内含物外渗，可以根据外渗液电导率值的变化鉴定细胞膜的伤害程度[21]。膜透性可以直接反应细胞膜受伤害的程度，MDA则间接反应细胞膜受伤害的状况[22]，MDA是膜脂过氧化的最终产物，其含量的高低可以表征膜脂的过氧化程度。郭淑华等[23]研究发现，在碱性盐胁迫条件下，8个葡萄株系的电导率和MDA含量均升高且耐碱性越弱的株系增加量越高，说明敏感品种和株系在碱性盐胁迫后细胞膜的完整性容易遭到破坏，膜脂过氧化作用明显增加，植物细胞受损伤程度更为严重，这与本研究结果一致。

植物的耐盐碱性是一个受多种因素控制的综合性状[23]，目前，主要通过中性盐与碱性盐模拟盐碱胁迫环境对葡萄的耐盐碱性进行研究。周万海等[24]通过研究不同水平的NaCl处理浓度对6个葡萄砧木品种生长发育特性的影响，得出‘5BB’和‘520A’耐盐性较强，‘SO4’和‘3309C’对盐较敏感，‘贝达’‘圣乔治’耐盐能力适中，这与本试验中‘5BB’属于高耐碱性结果一致；秦红艳等[25]通过研究不同NaCl浓度处理对不同葡萄品种叶片中叶绿素荧光参数的影响，得出‘双丰’和‘双优’叶绿素荧光参数受盐害影响大于‘京优’。在碱性盐研究方面，王振兴等[26]通过研究不同程度盐碱胁迫对不同抗逆性山葡萄品种的光合作用、PSⅡ活性以及生长发育的影响，表明‘左山一’较‘双优’的耐碱性更强；杜远鹏等[27]通过研究不同盐碱类型胁迫对葡萄植株离子分布的影响，表明碱性盐NaHCO3对植株影响最大。本试验采用的是NaHCO3与Na2CO3的混合盐溶液模拟碱胁迫环境对砧木杂种优株进行处理，并筛选出耐碱性强的杂种优株的方式。而在实际的栽培过程中，土壤结构及盐分组成都非常复杂，因此将结合田间实际情况对试材耐碱性作进一步研究。

在耐碱性评价中，叶片叶绿素含量，相对电导率值，MDA含量均为重要的测定指标，由于碱害严重度直接反应植株的受伤害程度并从表观上易于观察，而生理指标的变化除了受到碱胁迫的影响之外还受到周围试验环境以及植株不同生长势的影响，因此，本研究采用以碱害严重度作为主指标，将隶属函数值作为参考指标，对试验材料的耐碱性进行综合性评价。本研究筛选出了高耐碱和耐碱杂种优株15个，我们下一步的工作是对它们进行嫁接亲和性试验，结合前期的抗寒性、抗旱性、抗病性鉴定结果，最终选育出多抗性砧木新品种。