打顶后烟叶内源生长素含量的变化对绿原酸含量的影响

杨银菊，王树声，刘光亮，曾文龙，陈志厚，戴培刚，李琦瑶，陈爱国*

(1. 中国农业科学院烟草研究所/农业部烟草生物学与加工重点实验室，山东 青岛 266101；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.福建省烟草农业科学研究所龙岩分所，福建 龙岩 364000；4. 福建省烟草农业科学研究所南平分所，福建 南平 353000)

【研究意义】烤烟是以叶片为收获器官的一种经济作物，烟株进入生殖生长阶段以后，如果不去除生殖器官，营养物质就会大量的流向顶部花序，造成烟叶产量降低、品质下降[1]。因此打顶对提高烤烟的品质和产量极其重要。提高烟叶香气质量一直是我国烤烟栽培研究的热点。然而，烤烟香气组分种类繁多，不可能一一进行研究，因此，有必要针对某一种或几种特征香气成分开展合成积累研究。烟草中多酚类物质种类众多，主要包括绿原酸、芸香苷、莨菪亭，其中绿原酸含量与改善烟叶等级密切相关[2]。研究表明绿原酸含量在打顶后迅速上升，但其调控机理尚未完全阐明[3-5]，不利于特征风格的彰显和定向提升烟叶质量。【前人研究进展】打顶与烤烟产量和品质形成密切相关。一方面，打顶可以促进烟株根系生长，有利于养分和水分的吸收及烟碱的合成[6]。另一方面，打顶能协调烟株库源关系和物质代谢、分配途径，提高叶片中光合同化物分配比例，改善叶片中香气物质的含量和协调性，增加中上等烟叶产量[7-8]。此外，打顶对于烟株养分的吸收和分配、烟碱的积累规律及内源激素含量等均会产生影响[9-10]。打顶后烟株内源激素原有的平衡被打破，田效园等[11]研究发现烟叶内源生长素含量在打顶后显著降低，时向东等[12]报道烟叶中IAA含量在打顶后先升高后降低。【本研究切入点】打顶后绿原酸和内源生长素含量都发生很大的变化，那么打顶后烟叶中绿原酸含量的变化是否与生长素含量动态平衡被打破有关？目前，没有相关文献报道。【拟解决的关键问题】本研究通过添加外源生长素α-萘乙酸(α-Naphthalene acetic acid，NAA)和生长素极性运输抑制剂萘草胺(N-1-naphthylphthalamic acid，NPA)处理，利用高效液相色谱法和酶联免疫法来测定打顶后烟叶IAA含量、绿原酸含量以及绿原酸合成和降解关键酶的活性，旨在为探明打顶后烟叶中IAA含量对烤烟绿原酸生物合成的调控机理，从而定向提高烟叶品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种红花大金元种子由国家烟草种质资源库提供，种子经浸泡、灭菌、消毒后于 28 ℃黑暗条件下催芽，沙培45 d后进行移栽。盆栽试验于2016年9月20日至12月29日在中国农业科学院烟草研究所温室内进行，苗期日平均温度为(25±1)℃，现蕾到打顶期日平均气温(25±1)℃，盆高20 cm，直径25 cm，每盆装土8 kg，基质(腐殖酸含量≥5.0 %，有机质含量≥25.0 %)与土(棕壤，有效氮、磷、钾含量分别为97.29、8.84、216.98 mg/kg)1∶1(v/v)混匀后装盆，每盆种植1株。

1.2 试验处理

1.2.1 不同时期打顶对生长素含量和绿原酸含量的影响 分别在苗期(八叶一心期)和现蕾后10 d(移栽后85 d)设置打顶处理、打顶+NAA处理和不打顶处理。每个处理种植25株；苗期打顶处理采用刀片将幼嫩的未展开叶片及以上茎顶端组织切除，打顶+NAA处理在打顶后立即用脱脂棉在茎断面切口涂20 mmol/L抹萘乙酸；现蕾后打顶处理于50 %第一中心花开放时切除茎顶端(留叶18片)，打顶+NAA处理在打顶后立即用脱脂棉在茎断面切口涂30 mmol/L抹萘乙酸。

处理后第3、6、9和12天，每处理分别选取3株生长正常一致烟株的中部叶(苗期第4叶位，现蕾后10天第8叶位)，作为3个生物学重复；去除主脉后烟叶置于液氮中速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱中。生长素含量检测采用打顶后第3、6天的样品，多酚检测采用打顶后第3、6、9、12天的样品。

1.2.2 外源生长素及生长素极性运输抑制剂处理对绿原酸的影响 在苗期(八叶一心期)设置打顶处理、打顶+NAA处理、未打顶+NPA处理和未打顶处理。每个处理种植15株；打顶处理采用刀片将幼嫩的未展开叶片及以上茎顶端组织切除，打顶+NAA处理在打顶后立即用脱脂棉在茎断面切口涂20 mmol/L抹萘乙酸。未打顶+NPA处理在烟株顶端喷施80 mmol/L的萘草胺。

处理后第3和6天，每处理分别选取3株生长正常一致的中部叶，作为3个生物学重复；去除主脉后烟叶置于液氮中速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱中。用于生长素、绿原酸含量以及绿原酸合成和降解关键酶活性测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 绿原酸含量测定 参照YC/T 202-2006行业标准[13]，用高效液相色谱法(HPLC)测定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸含量。

1.3.2 生长素含量测定 参照Wang[14]的方法，利用高效液相色谱法(HPLC)测定IAA含量。

1.3.3 酶活性测定 采用酶联免疫法法利用PAL、C4H、4CL、C3H、HCT、POD和PPO活性测定试剂盒(江苏科晶生物技术有限公司)测定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、肉桂酸4-羟化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)、对-香豆酸3′-羟化酶(ρ-coumaroylester 3’-hydroxylase，C3H)、羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase，HCT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性。利用酶联免疫法(江苏绿叶生物技术有限公司)测定羟基肉桂酰辅酶A：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-CoA:quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)活性。

图1 不同时期打顶后NAA处理对烟叶绿原酸含量的影响Fig.1 Effects of exogenous NAA applications on the content of chlorogenic acid in tobacco leaves at the different topping stage

1.4 数据处理

采用SAS 9.1软件进行LSD多重比较法方差分析(P<0.05)，Excel和Origin9.1软件制作图表。

2 结果与分析

2.1 不同时期打顶及涂抹NAA处理对烟叶绿原酸含量和内源生长素的影响

2.1.1 不同时期打顶及涂抹NAA处理对烟叶绿原酸含量的影响 由图1可知，烟叶绿原酸含量在苗期打顶后显著降低。打顶后3～12 d内，打顶+NAA处理烟叶绿原酸含量呈现先升高后降低的趋势。其中除第9天以外，打顶处理烟叶中绿原酸含量均显著低于未打顶处理，而打顶+NAA处理烟叶中绿原酸含量显著高于打顶处理，升高到了未打顶水平。

由图1可知，现蕾后打顶烟叶绿原酸含量显著升高。现蕾后打顶3～12 d内，打顶+NAA处理烟叶绿原酸呈现先降低后增加趋势。打顶+NAA处理烟叶绿原酸含量在处理后6～12 d均高于打顶处理。在打顶后3 d，与打顶处理相比，打顶+NAA处理烟叶绿原酸含量降低24.9 %。在打顶后第6和9天，打顶+NAA处理烟叶绿原酸含量显著高于打顶处理。

2.1.2 不同时期打顶及涂抹NAA处理对烟叶内源生长素含量的影响 由图2可知，苗期打顶后3～6 d时，打顶处理烟叶IAA含量均显著低于未打顶处理，打顶+NAA处理烟叶IAA含量显著高于打顶处理，涂抹NAA后第3天时烟叶内源IAA升高幅度较大，处理后第6天时下降到未打顶烟叶的IAA含量水平。现蕾后打顶3～6 d时，打顶处理烟叶IAA含量先升高后降低，在第3天时显著高于未打顶处理，在第6天时，显著低于未打顶烟株。打顶+NAA处理烟叶IAA含量在处理期间持续最高。

2.2 打顶后烟叶生长素含量与绿原酸含量间关系验证

2.2.1 打顶后外源物质处理对内源生长素的影响 由图3可知，打顶后打顶处理烟叶IAA含量在3～6 d内均显著低于未打顶处理，打顶烟株叶片IAA含量分别降低21.1 %和7.5 %,打顶后添加NAA处理可以提高IAA含量，而喷施NPA显著抑制烟叶中IAA的含量,顶后第3和第6天时，与未打顶烟株叶片中IAA含量相比，未打顶+NPA烟叶中IAA含量分别下降59.3 %和52.3 %。

图2 不同时期打顶对烟叶生长素含量的影响Fig.2 Effects of exogenous NAA applications on the content of auxin in tobacco leaves at the different topping stage

图3 外源NAA和NPA处理对烟叶内源生长素含量的影响Fig.3 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the content of auxin in tobacco leaves

2.2.2 打顶后外源物质处理对绿原酸含量的影响 由图4可知，打顶后3～6 d内，打顶处理烟叶绿原酸含量显著低于未打顶处理，降低8 %左右；打顶+NAA处理绿原酸含量显著高于打顶处理，分别提高28.9 %和29.2 %；打顶+NPA处理烟叶绿原酸含量最低，显著低于其他3个处理。

2.2.3 打顶后外源物质处理对绿原酸合成关键酶活性的影响 由图5可知，处理后3～6 d时，与未打顶处理相比，除了打顶后第6天时HQT活性以外，打顶处理烟叶几种绿原酸合成关键酶活性显著升高。打顶+NAA处理烟叶C3H活性显著高于打顶处理，其余几种关键酶活性均显著低于打顶处理。未打顶+NPA处理烟叶除PAL以外，其他几种关键酶活性均显著高于未打顶处理。

图4 外源NAA和NPA处理对烟叶绿原酸含量的影响Fig.4 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the content of chlorogenic acid in tobacco leaves

2.2.4 打顶后外源物质处理对绿原酸降解关键酶活性的影响 由图6可知，在打顶后3～6 d，打顶处理烟叶POD活性显著高于未打顶处理，分别提高56.3 %、25.4 %。打顶+ NAA处理烟叶POD活性显著低于打顶处理。未打顶+NPA处理烟叶POD活性显著高于未打顶处理。处理后第3天时，打顶处理烟叶PPO活性显著高于未打顶处理和打顶+NAA处理，显著低于未打顶+NPA处理；第6天时打顶处理烟叶PPO活性显著高于未打顶处理，其余处理间PPO活性差异不显著。

图5 外源NAA和NPA处理对烟叶绿原酸合成关键酶活性的影响Fig.5 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the activity of key enzymes on the process of chlorogenic acid synthesis in tobacco leaves

图6 外源NAA和NPA处理对烟叶绿原酸降解关键酶活性的影响Fig.6 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the activity of key enzymes on the process of chlorogenic acid degradation in tobacco leaves

3 讨 论

PAL是苯丙烷代谢途径的第一个关键酶，也是连接初生代谢和次生代谢的关键酶，其活性受机械损伤、病原物等外界刺激的诱导[13-14]。因而PAL与植物生长发育、应激防御密切相关。本研究发现打顶后PAL活性增强，与袁卫瑜等[5]研究结果一致。打顶+NAA处理烟叶PAL活性显著降低于打顶处理，推测涂抹NAA后机械损伤作用可能被削弱了。C4H、4CL、C3H、HCT和HQT均是绿原酸合成过程的关键酶[15-18]，与未打顶处理相比，其他几个处理的这几个关键酶活性均显著升高，与绿原酸含量变化规律不完全一致，说明绿原酸含量的变化可能与降解有关。PPO是一类能够将酚类化合物氧化为醌的酶[19]，机械损伤、食草动物啃食、病源物侵染以及环境胁迫，均可诱导植物体内PPO活性升高[20-21]。黄永等[22]研究发现打顶可以提高PPO活性。张婷等[10]的研究也有类似的发现。本研究结果与之相似。

本研究通过添加NAA和NPA探讨了打顶后生长素对绿原酸的调控作用。结果表明打顶后涂抹NAA烟株叶片生长素含量升高，绿原酸含量也升高，而涂抹NPA的烟株叶片生长素含量降低，绿原酸含量也降低。说明打顶后烟叶生长素含量与绿原酸含量变化存在相关关系。时向东等[12]研究表明打顶后雪茄皮外包烟叶片中内源IAA含量在打顶呈现下降的趋势，本研究结果与之一致。Shi 等[23]研究也表明打顶后内源IAA含量降低。本研究发现打顶处理和NPA处理烟叶中内源IAA和绿原酸含量降低，而POD和PPO活性升高；打顶+NAA处理烟叶中内源IAA和绿原酸含量升高，POD和PPO活性降低。说明打顶后绿原酸降解速率大于合成速率，并受生长素调控。研究表明，IAA能显著降低PPO活性，促进酚类物质合成积累[24]。这与同一时期IAA浓度较高则绿原酸含量较高的规律一致。综上，打顶诱导绿原酸生物合成与打顶后内源生长素含量的的变化密切相关。

4 结 论

本研究采用高效液相色谱法和酶联免疫法，对不同处理的烟草叶片中3种绿原酸的同分异构体含量、IAA含量以及绿原酸合成和降解的关键酶活性进行分析，主要结论如下。

打顶处理和NPA处理烟叶中内源IAA含量降低，POD和PPO活性升高，绿原酸含量降低；打顶+NAA处理烟叶中内源IAA含量升高，POD和PPO活性降低，绿原酸活性升高。与未打顶处理相比， PAL、C4H、4CL、C3H和HQT活性在不同处理条件下均升高，说明打顶或NPA处理后绿原酸降解速率强于合成合成速率，打顶+NAA处理通过添加外源生长素减弱打顶的效应，绿原酸合成速率强于降解速率，不同处理条件下绿原酸含量的变化与POD、PPO活性变化密切相关。综上，打顶后内源生长素含量的变化与打顶调控绿原酸生物合成密切相关。