KaiA调控蓝藻生物钟的分子机制研究进展

李金奎，曹春雨，喻玲玲，刘森

1 三峡大学 医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002

2 湖北工业大学 教育部发酵工程重点实验室/工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068

昼夜节律现象广泛存在于生物体中，即使简单的原核生物蓝藻也表现出昼夜节律行为。生物体昼夜节律受到体内生物钟的调控，蓝藻生物钟是目前已知的最简单的生物钟，也是生物钟分子机制研究中最重要的模型之一。蓝藻生物钟系统主要包括输入途径、核心振荡器和输出途径3部分。核心振荡器是蓝藻生物钟的关键部分，它不同于DNA转录和RNA翻译所形成的负反馈振荡器，属于翻译后振荡器[1]。更为重要的是，蓝藻生物钟的核心振荡器是迄今为止唯一能仅通过将其组成蛋白 (KaiA、KaiB、KaiC三种蛋白) 混合在适当的缓冲溶液中即可实现体外重建的生物振荡器。因此，蓝藻生物钟核心振荡器一直是生物钟研究的热点，而解析其组成蛋白KaiA、KaiB、KaiC的结构和阐明其分子机制具有重要意义。

文中围绕蓝藻生物钟核心振荡器及其组成蛋白的结构和功能特点，针对时钟蛋白KaiA调节KaiC的酶活性、介导核心振荡器的时相重置、与CikA竞争KaiB的结合位点等方面对近年来的研究进展进行了综述 (图1)。

1 蓝藻生物钟核心振荡器简介

生物钟的分子机制一直以来都是研究者们感兴趣的内容。以往的研究认为，转录/翻译反馈环路(Transcriptional/translational feedback loop，TTFL)是唯一的生物节律产生机制[2]。但在2005年，Kondo等首次证明在蓝藻的生物钟体系中存在独立于基因转录的生物节律起搏器[3]——翻译后振荡器 (Post-translational oscillation，PTO)[4-5]。后期研究表明，蓝藻的生物钟由PTO和TTFL两部分组成，PTO是核心起搏器，TTFL则负责生物钟的输入和输出途径。PTO 和TTFL共同调节蓝藻的生物钟系统[6]。

图1 KaiA调控蓝藻生物钟的分子机制总体图示Fig.1 Overall diagram of the molecular mechanism that KaiA regulation cyanobacterial clock.

蓝藻生物钟PTO部分的核心，由一簇称为kaiABC的基因所编码的生物钟蛋白组成。该基因簇包括kaiA、kaiB和kaiC三个基因[7]。kaiABC基因簇所编码的蛋白KaiA、KaiB和KaiC是蓝藻生物钟核心振荡器的主要组成成分。蓝藻生物钟核心振荡器产生昼夜节律的计时机制表现在2个方面：基因簇转录水平呈高低的节律性变化；KaiA和KaiB共同作用使KaiC蛋白的磷酸化水平表现出节律性变化[8]。

2 蓝藻生物钟核心振荡器组成蛋白的结构和功能特点

蓝藻生物钟核心振荡器的组成蛋白KaiA、KaiB、KaiC之间存在多种相互作用，从而控制KaiC的磷酸化水平呈现节律性振荡。Kai蛋白中的任意两种均可以相互作用，任何Kai蛋白的缺失将使核心振荡器丧失功能，3种Kai蛋白同时存在时核心振荡器才能正常运行[9]。在此基础上，研究人员对KaiA、KaiB和KaiC的空间结构及功能特点进行了大量研究。

2.1 核心振荡器组成蛋白KaiC的结构和功能特点

KaiC的主要形式为6个单体组成的同源六聚体结构。每个KaiC单体具有2个结构域，分别是C端的CII结构域和N端的CI结构域。KaiC蛋白同时兼备自激酶 (Autokinase) 和自磷酸酶(Autophosphatase) 活性。激酶可以使KaiC自身亚基相互磷酸化，磷酸酶则推动KaiC去磷酸化。激酶和磷酸酶同时存在是KaiC发生磷酸化-去磷酸化周期性变化的基础[10]。KaiC的CII结构域上存在2个磷酸化位点，分别是431位的丝氨酸残基和432位的苏氨酸残基。因此，每个KaiC单体就具备4种可能的磷酸化状态，且能够按照顺序磷酸化[11]。

2.2 核心振荡器组成蛋白KaiB的结构和功能特点

KaiB蛋白有单体、二聚体、四聚体甚至多聚体等多种状态。在整个振荡周期中，KaiB蛋白会根据KaiC蛋白磷酸化状态的改变形成不同的聚合体。KaiB蛋白在这些不同的聚合体之间转换状态，以此来适应KaiC的状态进而与KaiC结合[12]。最近的研究发现，KaiB蛋白会在2个不同的三维折叠之间转换，从而提供时间延迟并使该振荡器的时相与地球旋转的时相相匹配[13]。

2.3 核心振荡器组成蛋白KaiA的结构和功能特点

KaiA蛋白有3个功能结构域：放大振荡幅度的N端结构域，产生节律性振荡的C端结构域，以及将N端和C端连接的中间结构域。

KaiA的N端结构域一般指第1-135位氨基酸残基。N端一半的结构展现出与传统信号接收结构域类似的折叠。但是与传统信号接收结构域相比，KaiA的N端结构域缺乏磷酰基转移反应所需的保守Asp残基，所以KaiA的N端结构域被认为是伪受体结构域[14]。

KaiA的C端结构域 (第180-284位氨基酸残基) 高度保守。该结构域由4个α螺旋组成，负责KaiA的同源二聚化，介导KaiA与KaiC相互作用，促进KaiC的磷酸化[15]。

连接N端和C端的中间结构域，包含第136-179位的氨基酸残基。最近的研究表明中间结构域会影响KaiA的活性状态[16]。

3 核心振荡器组成蛋白KaiA的调控机制

对于Kai蛋白相互作用的研究表明，KaiA刺激KaiC发生磷酸化，而KaiB的主要作用是结合磷酸化状态的KaiC，通过阻止KaiA与KaiC的作用，从而促进KaiC去磷酸化[9]。在核心振荡器的组成蛋白中，KaiC能发生磷酸化水平的变化，所以KaiC是振荡器的核心。在整个振荡周期中，KaiA直接作用于KaiC来调控KaiC的磷酸化状态，而KaiB主要是通过影响KaiA来间接调控KaiC的磷酸化状态[17]。因此，较多的研究集中于阐明KaiA对核心振荡器的调控机制。

3.1 KaiA通过调节KaiC多种酶的活性影响核心振荡器节律

KaiC兼具激酶、磷酸酶以及ATP酶等多种酶活性，并通过这些酶活性的共同作用调控核心振荡器的节律[18]。核心振荡器的节律表现在KaiC磷酸化水平的高低变化。通过体外重建实验和复合物结构解析，研究人员发现KaiA通过C末端与KaiC直接作用，这种相互作用能调节KaiC多种酶的活性，进而改变KaiC磷酸化水平的高低，从而影响核心振荡器的节律[19]。

3.1.1 KaiA调节KaiC激酶和磷酸酶活性影响核心振荡器节律的产生

KaiC的C末端488-497残基形成的A-Loop区 (简称A环) 有埋藏和暴露2种状态。A环的埋藏和暴露状态决定了KaiC自磷酸酶和自激酶的活性水平，进而影响KaiC的磷酸化水平[20]。当A环处于埋藏状态，KaiC自磷酸酶活性较高；当A环暴露时，KaiC自激酶活性占优势。在解析出的KaiC晶体结构中，A环处于埋藏状态，此时ATP的γ-磷酸基团与磷酸化位点的距离较远，KaiC难以发生磷酸化[21]。所以，KaiC自身的磷酸酶较激酶活性占优势，KaiC本身具有低水平的自激酶活性。

当KaiA、KaiC共同存在时，KaiA通过C末端直接结合KaiC的A环并稳定A环的暴露状态。A环的暴露使ATP更靠近磷酸化位点，KaiC自激酶的活性增加，伴随KaiC磷酸化水平升高。当A环无法稳定在暴露状态，ATP的γ-磷酸基团在空间上将远离磷酸化位点S431和T432，KaiC自磷酸酶活性占据优势，伴随KaiC磷酸化水平的降低。KaiA的C末端与KaiC的C末端通过结合和解离作用来决定KaiC磷酸酶和自激酶活性的倾向，产生KaiC磷酸化水平的高低变化，从而产生振荡的节律 (图2)[22]。通过实时量化KaiA与KaiC在亚秒级时间尺度上的相互作用后发现，KaiA对KaiC激酶的刺激作用为瞬时动态过程，且KaiC的磷酸化对KaiA的结合存在着反馈机制。随着KaiC磷酸化水平的升高，KaiA对KaiC激酶的刺激作用逐渐减弱。通过这种瞬时动态作用和反馈机制，可以稳定振荡体系不被体内的其他代谢活动所干扰[23]。

上述过程中，KaiB不直接与A环相互作用，也不影响KaiC自身磷酸化。相反，KaiB通过使KaiA失活而起作用，从而使高磷酸化状态KaiC的磷酸酶活性占据优势，发生去磷酸化[24]。

3.1.2 KaiA调节KaiC的ATP酶活性影响核心振荡器的周期

从结构上分析，KaiC的N和C末端结构域均含有典型的Walker’s基序。该基序是一种保守的氨基酸序列，广泛存在于各种GTP结合蛋白中，可以结合ATP[25]。研究表明，KaiC具有弱的ATP酶活性，并且ATP酶的活性会发生节律性波动，更为重要的是，KaiC的ATP酶活性对周期的形成具有重要意义[26-27]。

研究表明，KaiC的去磷酸化通过磷酸化反应的逆转而发生，振荡节律由KaiC可逆自磷酸化反应的周期性变化产生[28]。当KaiC单独存在时，其ATP酶活性保持恒定。当KaiA、KaiC共同存在时，KaiA刺激KaiC的ATP酶活性升高，加速KaiC结合的ADP与外源ATP交换来促进正向反应。而KaiB会抑制KaiA的作用致使KaiC的ATP酶活性降低，进而保留KaiC结合的ADP，从而促进逆反应。因为KaiA与KaiC的A环相互作用，而A环靠近CII结构域的ATP酶活性位点，所以KaiA可能通过调节A环的状态来影响ATP酶的活性，进而决定可逆自磷酸化反应的方向[29]。

图2 KaiA通过影响KaiC的A-Loop调节KaiC的酶活性Fig.2 KaiA regulates the enzymatic activities of KaiC by affecting the A-Loop.

综上所述，KaiA通过调节KaiC的ATP酶、激酶和磷酸酶活性来影响核心振荡器的节律。

3.2 KaiA通过活性状态的转换调控核心振荡器的时相

虽然单个Kai蛋白的结构和功能被广泛研究，但是Kai蛋白之间动态作用的机制仍存在众多疑问。例如，KaiA与未磷酸化的KaiC结合的分子细节，以及KaiC由磷酸化状态转变为去磷酸化状态这一动态过程中KaiA作用的分子机制均不清楚。近几年来的研究在KaiA与KaiC之间的动态相互作用方面取得了一些新的进展。

3.2.1 KaiA在Kai复合物中转变活性状态

研究表明，在整个振荡周期中，KaiA的活性状态会发生改变[30]。KaiC未发生磷化时，KaiA处于活性状态，通过C末端结合KaiC刺激KaiC发生磷酸化[15]。随着KaiC磷酸化水平的升高，KaiA的刺激能力减弱，当磷酸化的KaiC与KaiB结合时，KaiA对KaiC的刺激能力进一步减弱[31]。KaiA、KaiB和KaiC在相互作用形成KaiABC三元复合物后，KaiA转变为非活性状态，并且非活性状态KaiA的出现启动了KaiC的去磷酸化。

在振荡周期中，Kai蛋白以各种组合发生相互作用，重复装配和分解形成同源和异源多聚Kai复合物。在磷酸化开始阶段，KaiA迅速并反复与KaiC接触促进KaiC磷酸化，这种反复作用形成了动态的KaiAC复合物，此时KaiA处于活性状态。当高磷酸化水平的KaiC出现后，KaiC结合KaiB。KaiC与KaiB的结合则使KaiA逐渐失去活性状态，KaiC的去磷酸化阶段开始启动[24]。当稳定的KaiABC三元复合物形成时，该复合物会阻止KaiA与KaiC的反复作用，KaiA呈现为非活性状态[32]。当KaiC的磷酸化水平回降时，KaiB与KaiC分离，KaiA也被分离出来并恢复活性状态(图3)[30]。在体外振荡期间，KaiA有节律性地在不同的复合物中转变活性状态[33]。

图3 KaiA在活性态与非活性态之间转换进而调控核心振荡器的时相Fig.3 KaiA converts between active and inactive states to regulate the phase of the core oscillator.

3.2.2 活性态KaiA与KaiC形成动态变化的结合构象介导KaiC的磷酸化

研究者们在KaiA与未磷酸化的KaiC结合介导KaiC发生磷酸化的分子机制上存在着不同的观点。KaiC的C末端氨基酸序列无固定构象，是一段无序区域，而KaiA通过其C末端结构域与KaiC的该无序区域结合。电子显微镜分析KaiAC复合物的结果显示：KaiA与KaiC的结合可以是“tethered”模型或者是“engaged”模型。在tethered模型中，KaiA被KaiC的C末端捕获，但没有与KaiC的CII结构域的圆顶结构直接接触。在engaged模型中，KaiA接近并与KaiC-CII的圆顶结构直接接触[34]。通过NMR测定的KaiAC复合物的结构显示：KaiC的C末端衍生肽采用无规则卷曲构象结合在KaiA同源二聚体的C末端结构域之间的凹陷空间中[35]。通过X射线测定的KaiAC复合物结构显示：KaiC的C末端衍生肽采用α螺旋构象与KaiA结合[15]。几种技术测定的结构完全不同，无法确定KaiA-KaiC相互作用的正确模型。

本课题组利用“second-site suppressor”策略来研究KaiA和KaiC的相互作用机制，使用蛋白质序列分析以及诱变研究的手段，将所得数据与之前所报道的数据相结合，并建立了数学模型解释。本课题组的研究提出，KaiA和KaiC的固有无序尾部在结合过程中通过构象选择和诱导拟合经历显著的结构变化，两者间的作用为动态过程，形成不同的结合构象[4]。这包含了之前所用技术测定的结合构象。因为KaiC的C末端尾部是一个本质上无序区域，它可以采用不同的构象与蛋白质配偶体结合。所以，KaiC的C末端尾部在与KaiA作用时具有不同的构象是合理的。NMR结构中测定的构象可能是正在进行“蛋白质捕获”这一过程，X射线测定的折叠构象可能是真正发挥作用的结构。通过这种方式，KaiA与KaiC的相互作用可以被精细调节，并具有高特异性。

3.2.3 KaiA通过自我构象抑制切换活性状态介导KaiC的去磷酸化

近两年的研究也报道了KaiBC复合物使KaiA失活的具体细节。KaiA的中间结构域曾被认为起放大振幅和作为KaiB结合位点的作用[36-37]，而本课题组通过设计不同形式的KaiA蛋白，并结合分子动力学分析，提出KaiA的中间结构域会发生不对称的构象变化，并使KaiA在活性和非活性形式之间发生可逆性转换[38]。在KaiC磷酸化期间，KaiA二聚体的C末端结构域使用对称位点结合KaiC的CII结构域的C末端序列。KaiC磷酸化水平的升高促使KaiBC复合物的形成，进而和KaiA形成KaiABC复合物。晶体结构的数据指出，KaiA二聚体在与KaiBC复合物结合时经历较大的构象变化，KaiA中间结构域的β折叠发生旋转，并与KaiB的一个β折叠形成反向平行的β折叠结构。同时，KaiA中间结构域的α螺旋向下旋转到自身二聚体界面上的KaiC结合位点，从而阻断KaiC蛋白CII结构域的C末端多肽与KaiA的结合[30]。因此，通过远程变构机制，KaiA上的2个KaiC结合位点在自我抑制构象中被有效阻断，伴随KaiC去磷酸化阶段的启动。

本课题组的研究结果与晶体结构及核磁共振的数据共同表明，KaiA处于活性和非活性构象的动态平衡中，KaiB会诱导KaiA的自我构象抑制。因此，KaiA通过自我构象抑制的方式切换活性状态从而调控振荡器的时相。

3.3 KaiA与CikA竞争KaiB同一结合位点影响核心振荡器的信号传输

3.3.1 信号传输蛋白CikA的结构和功能

CikA蛋白在核心振荡器的信号输入和输出途径中都发挥重要作用，它与信号输出蛋白SasA属于同一蛋白激酶家族，是组氨酸蛋白激酶和自磷酸化酶[39]。CikA具有3个结构域：GAF结构域，组氨酸蛋白激酶 (HPK) 结构域和伪受体(PSR) 结构域。CikA的N端结构域与信号接受结构域类似，提示该结构域可能起接收信号的作用。CikA的C端PsR结构域会封闭HPK结构域上的磷酸化位点，从而阻碍了CikA发生磷酸化。当PsR结构域与S-KaiC (KaiC仅在S431位点磷酸化)相互作用时，HPK结构域的限制将被解除，CikA发生磷酸化。磷酸化的CikA充当RpaA的磷酸酶进而影响基因的节律性表达[40]。

3.3.2 KaiA与CikA竞争结合KaiBC复合物的相同位点

CikA可以感知细胞的氧化还原状态，并且通过与KaiABC蛋白质复合物的结合，重置基于KaiABC的昼夜节律振荡器[41]。KaiB与KaiC的混合物可以激活使RpaA去磷酸化的CikA的磷酸酶活性，间接说明了KaiBC复合物可以与CikA结合[13]。晶体结构的数据证实了CikA的PsR接收域直接与 KaiBfs-KaiC 复合物相互作用(KaiBfs为折叠转换态的KaiB)。KaiBfs-KaiC复合物也会与KaiA相互作用，将KaiA稳定在自我抑制构象，锁定KaiA处于非活性的状态。在形成的PsR-KaiB-KaiC三元复合物中，CikA的PsR结构域的β2折叠和KaiBfs的β2折叠相互平行作用。在KaiA-KaiB-KaiC三元复合物中，KaiBfs使用相同的β2折叠来结合KaiA的β2折叠。突变KaiBfs的β2链中的关键残基，同时降低了其与KaiA及PsR结构域的相互作用[30]。

3.3.3 KaiA与CikA的竞争影响振荡器信号的传输

如上所述，KaiA和CikA的PsR结构域结合在KaiB的相同结合位点。KaiBfs-KaiC会实现对KaiA的灭活，进而启动KaiC的去磷酸化。CikA通过与KaiA竞争KaiB上的同一位点来激活使RpaA去磷酸化的磷酸酶活性。通过这种竞争机制，可以将KaiC去磷酸化的信息传输到下游。

KaiA和CikA的N端在结构上均属于类信号转导蛋白，在振荡器的输入途径中，两者的N端结构域都对细胞的氧化还原状态敏感[42]。而在输出途径中，KaiA和CikA竞争结合同一位点，KaiB和SasA也是如此。SasA和CikA又会在输出途径中共同调节RpaA的活性进而影响下游的节律信号。因此，信号输入、中心振荡器和信号输出形成紧密耦合。

4 总结与展望

生物钟的分子机制被广泛研究，目前可将其分为TTFL和PTO这2种。相比TTFL，PTO更为广泛存在，在古菌、细菌、真核生物 (包括人)中都有发现[43]。因此，PTO机制可能是物种间更为保守的生物振荡机制。最早确认的PTO，是蓝藻中基于KaiA、KaiB、KaiC三个蛋白质的生物钟体系[3]。KaiABC体系并不是广泛存在跨物种保守的PTO。相比KaiABC，以过氧化物氧还蛋白为核心的氧化-还原节律性循环组成的PTO更为广泛和保守存在[44]。但是，KaiABC是目前唯一能在体外重现的PTO体系，并且生物钟系统的自我维持性、周期性及温度补偿性都可以在KaiABC中重现。所以，对生物钟PTO机制的研究中，蓝藻生物钟是最有利的研究模型之一。

虽然蓝藻生物钟是目前已知的最简单的生物钟，但由KaiA、KaiB、KaiC蛋白组成的蓝藻生物钟核心振荡器的动态机制十分复杂。目前对KaiA作用机制的研究揭示了其影响输入、输出信号，并调控核心振荡器，维持生物振荡的精确与稳定。对KaiA作用机制的研究仍存在一些需要解决的问题：例如KaiA的单体-二聚体转变是否在振荡系统中起重要作用；KaiA的N端结构域在动态周期中发挥怎样的功能；外界信号是否通过调控KaiA的N端结构域达到对该振荡体系进行调控；KaiA如何通过与细胞的代谢活动相关联进而稳定核心振荡器。对于这些问题的解决，可能需要通过生物学、物理学、数学分析等各种手段获取Kai蛋白在动态作用过程中的相关信息。利用X射线晶体衍射和电镜三维重构技术测定生物钟蛋白的三维结构有助于我们了解生物钟蛋白相互作用的分子细节。生物钟蛋白的进化树分析也能帮助我们理解不同物种间生物钟的潜在联系和机制。

这些问题的解决不仅对理解蓝藻的生物钟运行机制有重要意义，同时能以此为基础去研究更为复杂的真核生物如哺乳动物的生物钟，进而为生物钟的应用提供科学的指导。比如，哺乳动物因生物钟的紊乱造成肝脏代谢的异常，可以根据哺乳动物生物钟所处的时相特点给与相应剂量的药物治疗。肠道细菌也有明显的生物节律，肠道细菌的代谢紊乱将加重营养吸收方面的负担，理解肠道细菌的生物节律将能为食物的摄取和营养的吸收提供科学的依据。稳定的生物节律能让植物更好地进行光合作用，适应土壤环境，从而提高植物农作物的产量，对生物钟系统与外界环境信号联系机制的研究将为生物钟系统的稳定提供清晰的见解。所以，生物钟系统的研究在疾病预防、农牧业生产乃至进化层面具有重大意义。