黑龙江地区番茄斑萎病毒的鉴定及其部分生物学特征分析

王凯娜 战斌慧 周雪平

摘要近年来，番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV）在我国多个地区发生严重危害。本研究采用小RNA深度测序和RTPCR相结合的方法对采自黑龙江的番茄病毒病样品中的病毒进行了鉴定。提取番茄样品的RNA并构建小RNA文库进行测序，数据分析发现比对至TSWV基因组的reads数占比对到病毒核酸总reads数的92.64%，表明侵染此番茄样品的病原物可能是TSWV。利用RTPCR方法进一步确定侵染此番茄样品的病毒为TSWV，将其命名为TSWVHLJ1。对TSWVHLJ1的核苷酸序列进行分析并构建系统进化树，结果表明TSWVHLJ1与TSWV云南甜椒分离物（TSWVYNgp）的亲缘关系最近。介体传毒试验表明，西花蓟马可将TSWVHLJ1传播感染健康寄主植物。摩擦接种试验表明，TSWV黑龙江分离物能够侵染本氏烟、辣椒和番茄。这是我国首次报道在黑龙江地区发现TSWV的危害。

关键词番茄斑萎病毒;小RNA深度测序;RTPCR检测

中图分类号：S 436.412.1

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2018117

番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus（TSWV）是番茄斑萎病毒科 Tospoviridae番茄斑萎病毒属Orthotospovirus的代表种[1]，最早于1919年在澳大利亚被发现[2]，现已在多个国家和地区发生危害。据报道，TSWV能侵染84科1 090种植物[3]，如番茄、辣椒、茄子、马铃薯、花生、莴苣等，其引起的典型症状为植株矮小，顶芽下垂，幼嫩叶片扭曲，叶片黄化并出现坏死斑，直至整株枯死[4]。2011年TSWV被列为世界上危害最大的十大植物病毒之一[5]。

TSWV的基因组由S（2.9 kb）、M（4.8 kb）和L（8.9 kb）三条负义单链RNA组成[6]，S RNA编码非结构蛋白NSs，其互补链编码核衣壳蛋白N[7];M RNA编码非结构蛋白NSm，其互补链编码两个重要的病毒膜糖蛋白GN和GC;L RNA的互补链编码依赖于RNA的RNA聚合酶RdRp[8]。蓟马是TSWV的传播介体，传播TSWV的蓟马种类主要有西花蓟马Frankliniella occidentalis、烟蓟马Thrips tabaci和棕榈蓟马Thrips palmi等[9]，其中，西花蓟马传毒效率最高[10]。

RNA沉默（RNA silencing）是植物抵抗病毒侵染的一种适应性防御机制[11]，植物被病毒侵染后会产生大量病毒衍生的小RNA，这些小RNA能特异性降解与其同源的病毒的RNA。利用小RNA深度测序技术能获得这些小RNA序列，通过组装这些序列可以获得植物中病毒全基因组的序列信息，2009年，Kreuze等通过此种方法鉴定和发现了甘薯中的新病毒[12]。目前，小RNA深度测序技术已广泛应用于植物病毒的检测和鉴定。如宋静静等利用小RNA深度测序并结合血清学ELISA技术对广西冬种马铃薯病毒进行了鉴定[13];仇心钰等利用小RNA深度测序调查了我国北方地区甜菜病毒病[14];苏秀等利用小RNA深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原[15];王芳等利用小RNA高通量测序技术检测玉米中的病毒[16]。

1材料与方法

1.1样品来源

2017年7月于黑龙江省农业科学院试验田中采集到两株疑似感病的番茄植株，番茄叶片表现褪绿、斑驳、黄化、坏死等症状（图1），番茄样品采集后4℃运输，拍照后，保存于-80℃冰箱。

1.2小RNA深度測序及生物信息分析

将番茄样品送到北京诺禾致源生物公司进行小RNA深度测序。试验流程可分为四步：第一，样品总RNA的提取和质量检测。第二，cDNA文库构建，将样品中小RNA的3′端和5′端加接头，经RTPCR、cDNA合成、PCR富集，回收得到cDNA文库;第三，文库检测，使用生物信息软件Qubit 2.0对文库进行初步定量，使用Agilent 2100检测文库的插入片段大小，利用QPCR准确定量;第四，HiSeq/MiSeq测序及分析，用Velvet软件对文库中大小为18～26 nt的小RNA进行拼接，拼接结果在NCBI进行BLAST比对分析。

1.3番茄样品总RNA提取

采用 TRIzol法提取番茄样品总RNA。将0.1 g番茄样品放入研钵中，加液氮研磨至粉状，装入2 mL离心管，加1 mL TRIzol充分振荡混匀，室温静置5 min;取上清，加300 μL 三氯甲烷，涡旋振荡15 s，室温静置3 min，4℃，12 000 r/min离心15 min;取上清于1.5 mL离心管，加500 μL异丙醇，充分混匀，4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清;加1 mL 75%乙醇清洗沉淀两次，4℃，7 500 r/min离心5 min，弃上清后室温干燥，加30 μL RNaseFree water溶解RNA，置于-80℃保存。

1.4番茄样品全基因组的RTPCR扩增、克隆测序

以番茄样品的总RNA为模板，根据小RNA测序拼接得到的病毒核苷酸序列设计TSWV引物，对番茄样品全基因组序列进行RTPCR扩增（TaKaRa反转录试剂盒）。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。将条带回收连接到pEASYblunt克隆载体（TransGen公司），转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置过夜培养，挑取若干单克隆，以M13F（5′TGTAAAACGACGGCCAGT3′）和M13R（5′CAGGAAACAGCTATGAC3′）为引物进行菌落PCR检测，阳性单克隆送到擎科生物公司测序。

1.5番茄样品TSWV全核苷酸序列的生物信息分析

利用TSWV全基因组核苷酸序列与其他NCBI已公布的TSWV分离物的核苷酸序列进行比对，并从中选取TSWV的代表性同源序列，利用MEGA 7.0软件以邻接法（neighborjoining）构建TSWV全基因组核苷酸序列系统进化树，用Bootstrap检测各分支的置信度（重复1 000次），并进一步分析。

1.6介体传毒

将感染TSWV的番茄和辣椒植株分别置于养虫瓶中，健康西花蓟马由中国农业科学院植物保护研究所蔬菜害虫组高玉林老师馈赠，挑取健康的西花蓟马Frankliniella occidentalis 1龄若虫约200头放入上述养虫瓶中，饲养48 h，再用健康豆角饲养至成虫[17]。分别将6株健康的番茄和辣椒植株与30头上述西花蓟马成虫一同置于网笼中。两周后观察番茄和辣椒植株的症状，并单株提取植物样品RNA，利用TSWV的特异性引物TSWVM5F（5′ACAAGAGATTGTGTTCACCATC3′）与TSWVM3R（5′ATTCTTGATCTTCAGAGCCACA3′）对番茄和辣椒样品进行RTPCR检测。同时，利用TSWV的单克隆抗体对网笼中的西花蓟马进行DotELISA检测，确定西花蓟马是否带毒。

1.7汁液摩擦接种

将西花蓟马传毒成功的番茄和辣椒叶片用液氮冷冻研磨成粉末，加入0.1 mol/L磷酸缓冲液（60 mL 1 mol/L Na2HPO4、40 mL 1 mol/L NaH2PO4）混匀，4℃，8 000 r/min离心3 min，取上清于1.5 mL离心管中，置于冰上。摩擦接种3～5片真叶的本氏烟Nicotiana benthamiana、番茄Lycopersicon esculentum Mill.和辣椒Capsicum annuum L.，摩擦接种磷酸缓冲液的一组为阴性对照，试验植株在温度为25℃，光照16 h，黑暗8 h条件的温室中培养。

2结果与分析

2.1番茄样品小RNA高通量测序结果及数据分析

感病番茄样品经小RNA深度测序共得到14 800 277条reads，经质量控制后获得14 419 893条clean reads，clean reads占总reads数量的97.43%，其中unique reads 3 258 792条，与GenBank Virus RefSeq核酸数据库比对，比对上TSWV三条链的reads数占比对到病毒数据库的总reads数的92.64%。

通过分析不同长度的小RNA序列的百分比（图2），结果显示番茄样品的小RNA的长度主要集中在20～24 nt，其中21 nt和22 nt大小的小RNA为主要部分，分别占小RNA总数的30.34%和25.43%。

2.2番茄样品全基因组序列的扩增及序列相似性分析

以感病番茄样品的cDNA为模板，根据小RNA测序拼接得到的序列设计TSWV引物，对番茄样品全基因组进行RTPCR扩增，将扩增到的特异条带割胶回收，进行克隆测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对，利用软件DNAMAN 8拼接，获得TSWV番茄分离物的完整基因组序列。序列分析表明，TSWVHLJ1中RNA L、M、S三条链的大小分别为8 913 bp、4 772 bp和2 970 bp。TSWVHLJ1 RNA L编码病毒的RdRp，分子量为331.5 kD;TSWVHLJ1 RNA M编码病毒的非结构蛋白NSm，分子量为33.6 kD，其互补链编码两个糖蛋白GN和GC，分子量分别为78.0 kD和58.0 kD;TSWVHLJ1 RNA S编码非结构蛋白NSs，分子量为52.4 kD，其互补链编码病毒的外壳蛋白N，分子量为28.8 kD。

分别就TSWVHLJ1中的RNA L、M和S核苷酸序列進行序列相似性分析，NCBI BLAST比对结果显示，TSWVHLJ1 RNA L（GenBank登录号MG878873）、RNA M（GenBank登录号MG878874）和RNA S分离物（GenBank登录号MG878875）分别与TSWV云南甜椒分离物（TSWVYNgp）的RNA L（GenBank登录号KM657122）、RNA M（GenBank登录号KM657119）和RNA S（GenBank登录号KM657116）的核苷酸相似性最高，为99.63%、99.52%和99.73%。

2.3番茄样品全基因组序列的系统进化树分析

对TSWVHLJ1全基因组核苷酸序列与世界各地多种TSWV分离物的核苷酸序列进行比对，利用MEGA 7.0软件以邻接法（neighborjoining）构建系统进化树（图3）。结果表明，TSWVHLJ1 RNA L与我国云南的TSWVYNgp（KM657122）亲缘关系最近，与TSWV云南番茄分离物（JF960237）、辣椒分离物（KM657120）、莴苣分离物（JN664254）和烟草分离物（KM657121）在进化树中归于一支，亲缘关系较近（图3a）。此外，TSWVHLJ1 RNA L与韩国报道的TSWV甜椒分离物（KY021437）和葎草分离物（LC273305）系统进化关系也较近（图3a）。TSWVHLJ1 RNA M与多种云南地区报道的分离物，如甜椒分离物（KM657119）、辣椒分离物（KM657117）、番茄分离物（JF960236）、烟草分离物（KM657118）等在进化树中归于一支，亲缘关系较近（图3b）。另外，TSWVHLJ1 RNA M还与韩国报道的甜椒分离物（KY021438）和葎草分离物（LC273306）亲缘关系也较近（图3b）。TSWVHLJ1 RNA S与TSWVYNgp（KM657116）亲缘关系最近，与云南地区的番茄分离物（JF960235）和芹菜分离物（KU356854）等、江苏地区的番茄分离物（JF960235）和莴笋分离物（KU976396）及山东的烟草分离物（KM657115）在进化树中归于一支，亲缘关系较近（图3c）。综上，TSWVHLJ1与我国云南的分离物具有最近的亲缘关系。

2.4西花薊马对TSWVHLJ1的传播

为了探究西花蓟马能否传播TSWVHLJ1，将6株健康的番茄和辣椒植株分别与30头饲毒的西花蓟马成虫一同置于网笼中，以健康蓟马取食的植株作为对照，2周后发现，饲毒蓟马取食的番茄和辣椒植株呈现黄化、坏死等明显的病毒侵染症状（图4a）。单株提取番茄和辣椒样品的RNA，利用TSWVHLJ1的特异性引物TSWVM5F/TSWVM3R对番茄和辣椒植株进行RTPCR检测，结果显示12株植株均扩增到约为750 bp的目的条带，而阴性对照中未检测得到任何条带（图4b）。网笼中西花蓟马的DotELISA检测结果表明，西花蓟马体内存在TSWV（图4c）。以上结果证明，西花蓟马能成功获取TSWVHLJ1并能传播至健康植株。

2.5TSWVHLJ1的生物学接种试验

取蓟马传毒发病的番茄样品的汁液摩擦接种本氏烟、番茄和辣椒。结果表明：本氏烟系统叶片在接种后第9天出现明显的卷曲，第13天叶片呈黄化、坏死症状;番茄在第14天呈植株矮小、黄化、坏死斑症状，最后整株枯死;辣椒在接种后10 d出现明显的卷曲，接种后15 d呈黄化、花叶、斑驳症状（图5）。

3结论与讨论

番茄斑萎病毒（TSWV）是限制番茄生产的重要因素，TSWV最早于1919年在澳大利亚[3]发现，现已在巴西、阿根廷、意大利、法国、美国等[2]多个国家和地区发生危害。TSWV于20世纪90年代在我国正式被鉴定[18]，2000年以后，在云南很多作物上发现该病毒，其危害严重。目前，TSWV已从国内最初被发现的云南[5]、四川[18]等地向国内其他省市快速扩展，北京[19]、山东[20]、宁夏[21]、广东[22]等多个省市地区都有发现，造成重大的经济损失。2017年7月，我们在黑龙江省农业科学院试验田采集了表现褪绿、斑驳、黄化、坏死等症状的番茄叶片，采用小RNA深度测序和RTPCR结合的方法对样品进行鉴定，表明侵染此番茄样品的病原物为TSWV。汁液摩擦接种表明，TSWV黑龙江分离物能够侵染本氏烟、辣椒和番茄。这是我国首次在黑龙江地区发现TSWV的危害。因此，加强进出口检验检疫和国内种苗交易的监管和检测，从而控制病毒的人为传播对防止番茄斑萎病毒病扩散具有重要意义。

近年来，小RNA深度测序技术在多种植物病原物鉴定方面发挥了重要作用，特别是对新病毒的鉴定。小RNA深度测序技术拥有传统检测方法无法比拟的优势，不需要事先了解病毒分子水平的情况也不需要离体培养。通过小RNA深度测序及拼接技术可以得到病毒的全基因组，对病毒的鉴定和分类有很大帮助，也能了解病毒的流行病学信息。利用TSWVHLJ1的全基因组核苷酸序列与世界各地多种TSWV分离物的核苷酸序列比对并构建系统进化树，结果表明TSWVHLJ1与我国报道的TSWV云南甜椒分离物亲缘关系最近，与TSWV韩国分离物JJ和HJ在进化树上处于同一大支，亲缘关系也比较近。

西花蓟马是TSWV最重要的传播介体，西花蓟马传播病毒造成的损失远大于其自身为害带来的损失，控制西花蓟马的种群数量对TSWV的防控极为重要。2003年，西花蓟马在北京被发现后，迅速扩散并局部暴发成灾，对我国的农作物生产造成极大的危害[23]。TSWV寄主种类多，如番茄、辣椒、茄子、南瓜、黄瓜、丝瓜、菜豆和豇豆等，防治难度大。目前，对TSWV的防治方法主要有[24]：一、治虫防病，控制TSWV的介体蓟马，定期喷施杀虫剂，如螺虫乙酯、乙基多杀菌素、苦参碱、高效氯氰菊酯等[25];二、及时彻底清除田间杂草，严格铲除病苗并进行土壤消毒，不宜在农田周围种植感病植物，控制感染源;三、喷施抗病毒剂[26]，可通过诱导植物对病毒产生抗性，抑制病毒装配，钝化病毒的侵染性等方式起作用;四、种植抗病的品种，如‘Red Defender、 ‘Mt Glory、‘Bella Rosa、‘Quincy等[27]。

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（責任编辑：田喆）