第27 届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验4·分子生物学

张 立 陶若婷 张雁云 范六民 戴俊彪

（1 北京师范大学生命科学学院 北京 100875 2 北京十一学校 北京 110000 3 北京大学生命科学学院 北京 100871 4 清华大学生命科学学院 北京 100084）

总分：100 分 时间：90 min

这场考试中， 你将同时为2 个目的完成一项PCR-RFLP 实验。

·鉴定分析药物代谢酶（NAT2）的基因型，以决定肺结核（TB）治疗药物口服的剂量。

·未知身份活检样本的法医鉴定。

实验包括5 个任务：

·任务1：设计RFLP 实验（17 分）

·任务2：完成RFLP 实验的操作（44 分）

（注意： 电泳实验必须距考试开始75 min 内开始。 75 min 后，将不允许跑胶）

·任务3：法医鉴定未知身份的活检样本（9 分）

·任务4：解读患者基因型（12 分）

·任务5：根据患者基因型确定药物用量(18 分)请注意以下事项：

·切记，请用铅笔清楚填写学生代码，务必填写在答题卡第1 页要求的框内。

·在答题卡上答题（用铅笔和橡皮擦）。 只有答题纸上的答案才有效。

·请确保您在考试开始时已收到列出的所有材料和仪器。如果材料不全，请立即举红牌示意实验室助理。

·在实验过程中，请正确使用仪器。任何溢洒的化学品或打碎的仪器都不会补充。但是，如果任何设备出现故障， 请举起红牌。 实验室助理会帮忙，必要时更换一个新设备。

材料和设备

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所有实验室都提供包括计算器、铅笔（2B）、橡皮擦和直尺在内的其他工具。

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任务1 PCR-RFLP 实验设计（17 分）

前言

异烟肼（INH）是治疗结核病（TB）的重要药剂。尽管该疗法疗效显著，但仍有治疗失败（无效的治疗）和难以处理的副作用（最常见的是肝损伤和有时致死）。 INH 乙酰化被认为是导致药物引起肝中毒的主要原因。图1 提供了非诱导肝酶芳香胺的N-乙酰基转移酶2 型（NAT2）催化INH 乙酰化的主要途径。 每个个体乙酰化速率恒定，但不同患者的速率不同。 人类群体可根据乙酰化速率分为3 个不同的表型组：慢、中、快乙酰化者。NAT2 慢乙酰化患者被INH 诱导的肝中毒发病率更高。 相反，快乙酰化患者组中更容易发生治疗失败。 通常，快乙酰化组人群的基因型在3 个位置［NAT2*4（C481，G590，G857）］的SNP 都是纯合野生型。 中乙酰化人群是杂合子，在一个位置有单个SNP 的突变，即3个 位 置 中 的 一 个NAT2*5 （C481T）、NAT2*6（C590A）或NAT2*7 （G857A）（见图2a 和2b）。 慢乙酰化人群则有不止一个等位基因突变（可以是一个位置的2 个等位基因，或多个位置的突变）。

图1 NAT2（N 乙酰基转移酶）催化的INH 代谢

NAT2 基因型可以通过等位基因特异的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)实验测定。

接受相同剂量的INH 的不同NAT2 基因型患者血液INH 浓度的分析表明，慢乙酰化人组的血清中INH 的浓度比快和中乙酰化组高2～7 倍。 因此，NAT2 基因分型，可以帮助实现INH 剂量使用的个性化。

在本实验中， 你将收到从3 个结核病患者P1、P2 和P3 全基因组DNA 中提取的NAT2 基因的PCR 产物，以及从这3 个患者提取的未标明的活检标本PCR 产物X、Y 和Z。你需要设计和实施PCR-RFLP 实验， 以确定每个患者的NAT2 基因型，并且鉴定其活检标本。 在PCR 产物上，用适当的限制性内切酶（RE）鉴定基因型。 用所获得的数据，确定活检X、Y 和Z 的身份。 最后，确定患者P1、P2 和P3 最适宜的INH 剂量。

图2（a）

在答题卡上的图中完成期望的RFLP 结果模式（pattern），请用铅笔作答，画出4 个NAT2 等位基因NAT2*4 （野生型），NAT2*5（481T），NAT2*6（590A）和NAT2*7（857A）限制性酶切完全消化PCR 产物所期望产生的条带。 杂合子的例子已经提供。

图Q1.1

本项任务中， 你需要进行共12 管样本的RFLP 反应，鉴定3 位患 者（P1、P2、P3）和3 个活体样本 （X、Y、Z） 的野生型、NAT2*5 等位基因（标为a）、NAT2*7 等位基因（标为b）。 请在每个PCR 管中，使用7.0 μg DNA，限制性缓冲溶液，需要使用RE 时使用l.0 μL。

问题1.2 （5 分）

请设计患者（P1～P3）和样本（X～Z）的限制性消化或者NAT2 基因型分析，在l0 μL 的体系中。请在答题卡上完成下表。

表Q1.2

任务2 完成RFLP 实验操作（44 分）

注意：

·电泳时，你只操作使用FlashGel 系统的2 个部件，胶盒（Cassette）和电泳槽（Dock）（图3），而电源和摄像机由实验室助理操作。 为达到最佳效果，加样前，用去离子水先冲洗加样槽。 观察条带时，关灯（用电泳槽Dock 上的开关），并戴护目镜。

·你可以再要一块胶，但是会罚去20 分。

·使用加样枪加样前， 用离心机短时间离心所有试剂 （务必在对侧放置相应离心管以平衡离心机，如果只有一个管，用空管平衡）。

图3 FlashGel［8］水平电泳系统（A）胶盒Cassette（B）胶槽Dock（C）照明开关（D）相机（E）电源

该实验过程包括2 个阶段：PCR-RFLP 消化和电泳。

第1 步（准备RE 消化的离心管）：用细尖记号笔将12 个微管（Microtube）标记为P1a，P1b，P2a，P2b，P3a，P3b，Xa，Xb，Ya，Yb，Za，Zb，对应于3 名患者（P1，P2 和P3）和3 个活检样本用Kpn I 或者Bam HI 消化后的基因组DNA 的PCR 产物。

第2 步（限制性酶消化混合物的制备）：根据你设计的限制性酶消化反应（你答题卡上的表Q1.2），在步骤1 标记你的微管中制备限制性酶消化的混合物。用加样枪在管中轻轻吸加样本进行搅拌，或者用手指轻弹管底。制备混合物时，切勿污染样品（每次操作使用一个新枪头）。 用适合的适配器离心沉降样品（离心前请平衡离心管）。 制备过程中和离心后，请总是将离心管置于冰上。

第3 步（温育消化反应，准备预制凝胶）：所有的离心管都准备好后，从冰中取出，置于你颜色编码的泡沫浮架上，在指定给你的37℃水浴中（位于座位后面）孵育5 min。孵育5 min 后，请务必取回自己的样本。

在37℃孵育时， 你可以准备之前参观实验室时看过的胶块（预制凝胶），步骤如下：

·用剪刀剪开包装的一侧，小心取出胶块。

·取出胶块的白色封条（但不要移除侧面的透明封口）。

·用洗瓶使用去离子水冲洗加样孔（务必冲洗所有加样孔）， 倾斜胶块， 排去多余液体，用Kimwipe 纸吸去多余液体（不要直接吸加样孔）。

·将胶块加入电泳槽（如果需要帮助，请举起红卡）后可以准备上样。

第4 步（RE 灭活，停止消化反应）：5 min 的限制性酶消化结束后，取回自己的离心管，将其移至附近的80℃加热装置（如有必要，用纸巾吸干微管外多余的液体）孵育5 min。

第5 步（DNA／PCR-RFLP 产物染色）：经过80℃的孵育后，离心冷却，并将试剂离心至管底。在每个离心管中加入2.5 μL DNA 染色染料（标记为D）。充分混合,然后再次使用微型离心机轻微离心一次。

第6 步（电泳上样）：12 个样品（P1a - Zb）和100 bp ladder 溶液（标记M）分别上样5 μL（注意：每个泳道体积上限是5 μL，上样不要超过5 μL）。 请务必将枪头小心置于加样孔上方，轻轻加入样品，不要洒出。 请严格按照以下顺序，依次加入样品至各泳道（从左侧开始，加样孔在离你远的那端）。

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第7 步（运行电泳）：加样完成后，举起绿卡。实验室助手将启动电泳。 电源的电压应设为200 V。大约7～8 min （当Ladder M 最快的条带已经跑过凝胶2/3 处）后，再次举起绿卡，通知助手断开（关闭）电源。

第8 步（记录凝胶数据）：助手将电泳槽从电源盒断开。 电泳槽插上电源插座，将灯打开。 观察凝胶（带护目镜），并用铅笔在答题卡的图Q2.1 上画出观察到的各条带 （注意打印好的ladder M的标度， 画出的任何和下一步将制备的胶照片不匹配的泳道或条带都不能得分）。

第9 步（拍摄凝胶）：完成绘图后，在标签贴纸上标明自己的学生号（Student ID），附在你胶块的框上（红色的部分）。 举起绿卡，将带胶块的电泳槽交给实验室助理。助理将会为凝胶拍照，并将照片附于你答题卡上（注意，没有按照第6 步中顺序加样的结果将不计分，但是可以用于后面的题）。

问题2.1 画出凝胶图。 （18 分）

问题2.2 将照片贴在答题卡上（26 分）

任务3 活检样品的法医鉴定（9 分）

问题3.1 （9 分）

根据任务2 中3 个患者（P1～P3）样品，和3个活检标本的PCR-RFLP 谱， 对比匹配样本X、Y、Z 分属哪位患者，在答题卡的表格中填入答案。

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注意：任务4 和任务5 答题时，如果你未能在任务2 中成功分析出患者P1、P2、P3 的基因型，你可以根据活体标本（X、Y、Z）的结果谱进行推测，在要求填入“患者”的栏目填入X、Y、Z，但是每次替代都会被扣除1.5 分。

任务4 患者的基因型解读（12 分）

问题4.1 （9 分）

根据你Kpn I（NAT2*5 或C481T）和Bam HI（NAT2*7 或G857A）消化后，PCR-RFLP 的结果，推断3 名患者的基因型， 在答题卡上填写完成表格。 基于TaqⅠ消化后NAT2*6（G590A）位点3名患者的基因型已经给出。

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问题4.2 （3 分）

基于你对3 名患者基因型的判断（问题4.1），推断他们乙酰化的表型， 请在答题卡上相应方块内打勾（√）。

A.患者P1 B.患者P2 C.患者P3

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任务5 根据患者基因型决定用药剂量（18 分）

前言：2015 年，Jung A J 和他同事 （Journal of Drug Design，Development and Therapy；9：5433-8）研究了206 例接受标准剂量INH 治疗 （5 mg/kg 体重，通常每天用药300 mg INH）的肺结核患者，发现在快乙酰化患者用药后2 h 血清中，INH 含量显著低于慢乙酰化组。 包含年龄、 性别、 体重和NAT2 基因型的多重线性回归分析表明，NAT2 和体重独立影响INH 浓度（P＜0.001），而其他因素不影响INH 浓度（P＞0.05）。

根据回归分析，INH 浓度的最佳预测公式如下：

血 清INH 浓 度（mg/L）=13.821-0.1×（体 重，kg）-2.273×（高活性NAT2 等位基因的数量，0，1，2）（公式1）

在此公式中， 高活性NAT2 等位基因的数量（0，1，2），分别相应于3 种表型，即慢、中和快乙酰化者。

INH 最有效的抗结核治疗，是用药2 h 后，血清中INH 浓度降至3.0～6.0 mg/L 的范围内。 根据图4中药物标签上显示的INH 的浓度， 请判定适合于P1、P2、P3 3 位患者的处方。根据下面2 个步骤作答（问题5.1 和5.2）。 假设3 名患者体重都是70 kg。

问题5.1 （6 分）

假设， 每名患者服用300 mg INH 的日剂量，根据公式1 和患者的基因型估算用药2 h 后P1、P2、P3 血清中INH 的浓度。 完成答题卡上的表格（结果保留3 位小数）。

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问题5.2 （12 分）

请根据每位患者相应的NAT2 基因型， 决定他们每天最少需要吃多少片药（见图4），以保证抗肺结核治疗的最佳效果。 填写完成答题卡上的表格（请填写整数）。

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（待续）