第27 届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验3·生物化学与微生物学

范六民 戴俊彪 张 立 陶若婷 张雁云

（1 北京大学生命科学学院 北京 100871 2 清华大学生命科学学院 北京 100084 3 北京师范大学生命科学学院 北京 100875 4 北京十一学校 北京 110000）

总分：100 分；时间：90 min。

本次考试包括下列3 个实验

实验1：蛋白的表达、纯化和鉴定（40 分）

实验2：咖啡提取物的抗氧化活性（30 分）

实验3：乳酸发酵（30 分）

请注意以下内容：

·请把答案填写在答题卡上。

·请检查所有的材料和设备， 确定你已经收到所有列出的材料和设备。

·实验过程中，请正确使用仪器设备。任何溅洒的试剂和损坏的仪器都无法再次获得。

·实验1 中的凝胶电泳不得在最后30 min内完成，建议你首先开展实验1。

·在实验2 中， 请注意获取分光光度计上的读数，否则无法回答该问题。

材料和设备

设备和用于3 个实验的材料：

名称 数量P1000 微量移液器（100～1 000 滋L） 1件P200 微量移液器（20～200 滋L） 1件P20 微量移液器（2～200 滋L） 1件用于P1 000 微量移液器的枪头 1盒用于P20 和P200 微量移液器的枪头 1盒去离子水（dH2O） 1瓶微量试管（EP 管）架 1件用于液体废物存放的圆形塑料容器（废液） 1件用于固体废物存放的方形塑料容器（固体废物） 1件计时器 1件手套 1副卫生纸 1盒胶1管学生条码标签 5件红牌 1件绿牌 1件计算器 1件记号笔 1件防护眼镜 1件

用于实验1：

名称 数量SDS-PAGE 凝胶电泳槽和电源 1套凝胶电泳梳子 1件凝胶容器（含学生代码） 1件1.5 mL 离心管 10 件装配有聚丙烯酰胺凝胶盒的凝胶电泳槽 1件包含2× SDS-PAGE 上样缓冲液的品红色离心管（缓冲液） 1件装有8 滋L 蛋白质marker 的黄色微离心管（M） 1件装有30 滋L 细胞，不含有IPTG 的离心管（NO_IPTG） 1件装有30 滋L 细胞，含有IPTG 的离心管（IPTG） 1件装有IPTG 诱导后，30 滋L 细胞裂解液离心后所得沉淀的离心管（Pellet） 1件装有IPTG 诱导后，30 滋L 细胞裂解液离心后所得上清的离心管（Super） 1件装有30 滋L 纯化后蛋白质的微量离心管（Puri-P） 1件包含40 mL 的SDS-PAGE 染色溶液的Falcon 试管（绿帽）（STAIN） 1件

用于实验2：

名称 数量带有学生代码的96 孔板（请勿触碰板的底部） 1件包含300 滋L，1 mg/mL 抗坏血酸溶液的蓝色离心管（AA） 1件包含300 滋L，5 mg/mL 咖啡提取物的蓝色离心管（CC） 1件包含15 mL，0.2 mnol/L DPPH 溶液的棕色瓶（DPPH） 1件

用于实验3：

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实验1 蛋白质的表达、纯化和分析（40 分）

介绍：H 和B 蛋白质是气单胞菌（Aeromonas hydrophilas）的2 个重要蛋白。为了研究它们，科学家希望在大肠杆菌中共同表达它们。因此，B 基因和H 基因分别被克隆到表达载体P1 的多克隆位点1（MCS-1）和多克隆位点2（图1.1）。 所得到的载体P1-b-h 被转化到大肠杆菌中，利用IPTG 诱导蛋白表达。然后通过亲和层析，利用镍柱纯化带有6xHis 标签的蛋白质。 最后通过SDS-PAGE，针对蛋白质分子量的大小， 对纯化后所获得的蛋白进行分析评价。 注意：H 的分子量比B 小。

图1.1 表达载体的P1 的总览图

带有P1-b-h 壳的大肠杆菌单菌落在50 mL的LB 培养基中，37℃培养至OD600为0.6。 为了分析重组蛋白的表达和纯化， 科学家已收集以下这几个细胞和蛋白样品：

·NO-IPTG：1 mL 培养液被转移到一个培养管中，在20℃生长16 h（OD600=2.4）后离心。 弃去上清液后将细胞沉淀重新悬浮于50 μL H20 中，加入50 μL 2× SDS-PAGE 上样缓冲液混合，得到100 μL 样品。

在剩余的49 mL 培养液中，添加IPTG。在20℃培养16 h，诱导蛋白表达。

·IPTG：取1 mL IPTG 诱导后的菌液（OD600=1.4）离心。 弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于50 μL H20 中，然后加入50 μL 2× SDS-PAGE 上样缓冲液混合，得到100 μL 样品。

将剩余48 mL 培养液离心，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于2 mL 缓冲液中；将细胞悬浮液裂解，并随后离心分离。 上清液和沉淀均需要收集。

·Pellet（沉淀）：将IPTG 诱导后细胞裂解液离心所得的沉淀物重新悬浮于2 mL 缓冲液中，然后加入2 mL 2× SDS-PAGE 上样缓冲液 （沉淀储存液）混合。

·Super（上清）：将10 μL，IPTG 诱导后的细胞裂解物中得到的上清液10 μL 2× SDS-PAGE上样缓冲液混合。

·Puri-P（纯化后的蛋白）：剩余上清液加入到用于蛋白质纯化的镍柱。 纯化后的蛋白质用2 mL 洗脱缓冲液进行洗脱。取10 μL 洗脱所得的蛋白质与10 μL 2× SDS-PAGE 上样缓冲液混合。

将所有用于SDS-PAGE 分析的样品在100℃煮沸5 min。

设计SDS-PAGE 实验，分析蛋白的表达。

用于SDS-PAGE 分析的总蛋白标准终浓度必须相当于5×l06个细胞／μL。 首先，计算每个样品中的细胞浓度。 OD600值为1 相当于知8×108个细胞／mL。 请考虑操作过程中各样品的稀释度。

问题1.1 （6 分）

计算并在下表中填写样品的体积（μL）。 用一位小数。

管1 管2 管3 管4 管5 管6样品 蛋白marker NO-IPTG IPTG Pellet SuerPuri-P储液（μL） 5 14.9 14.9 15 H2O（μL） 5 12.5 12.5 12.5 2× SDS-PAGE 缓冲液 10 12.6 12.6 12.5总体积（μL） 20 40 40 40 40 40

实验步骤

·根据上面的表格， 准备在提供空离心管所有SDS-PAGE 样品。 通过上下吹打4～5 次混匀各样品。

完成此步骤后，请举起绿卡。助手将引导你去上样区，并帮助将你的学生代码粘贴到电泳槽上。

·将每个样品点样20 μL 到SDS-PAGE 胶上，必须按管1～6 的顺序上样。 为上样，请使用P20移液器和枪头吸取20 μL 样品， 并小心地将枪头置于加样孔的顶部（1.2）。

图1.2 在SDS 凝胶样品装载

·实验助理将运行SDS-PAGE 20 min。 他会告知你设置定时器20 min。

在SDS-PAGE 进行过程中你可以做另一项实验。 20 min 后， 请举起绿卡， 通知助理将SDSPAGE 凝胶返还给你。

·如图所示（图1.3），将塑料盒中的SDS-PAGE凝胶用凝胶梳子打开，将凝胶放到胶容器中。

图1.3 从凝胶盒中取出SDS-PAGE 凝胶操作示意图

步骤1）将梳子插入凝胶盒各个槽口，转动梳子把凝胶盒撬动。从顶部的槽口开始，沿着盒的每一侧向下移动。

步骤2）当两侧打开后，将梳子放置在斜边底角板之间的45 度角，用力扭转。

步骤3）轻轻将2 个盒分开。

·在凝胶容器摇加入40 mL 的染色溶液（STAIN），放置在摇床上转动染色10 min。

·将凝胶容器中的染色溶液倒入废液桶，使用去离子水清洗凝胶3 次。

完成上述操作后，举起绿卡，请助理帮助拍取凝胶照片。

问题1.2 SDS-PAGE 结果（10 分）

得到SDS-PAGE 凝胶照片后， 将其粘贴在答题卡指定的地方。

问题1.3 （4 分）

基于图1.4A 提供的资料，将至少5 个标记蛋白，根据它们的分子量和相对迁移的Rf 值，在答题卡规定的图形文件上取点作图 （Rf=蛋白质迁移距离／染料前端迁移距离）。

图1.4 蛋白marker（A）和方格纸（B）

问题1.4 （4 分）

利用问题1.3 中的图标及SDS-PAGE 胶图，分别估算蛋白H 和B 的分子量。

问题1.5 （4 分）

基于SDS-PAGE 结果， 判断下列陈述的对和错。 在答题卡上用“√”表明正误。

A. H 蛋白在含有IPTG 的LB 培养基中是过表达的

B. B 蛋白在镍柱结合缓冲液中是完全可溶的

C. H 和B 蛋白相互作用

D. 大部分的重组蛋白被结合到了镍柱上

问题1.6 （4 分）

根据P1 表达载体（图1.5）的详细酶切图谱，判断下列陈述的对错。 在答题卡上用“√”表明正误。

以下陈述正确的打“√”，错误的打“×”。

A. Sal I 和Bam HI 可以用于将b 基因插入到MCS-1

B.为了能同时进行表达，基因h 和b 应以相同的转录取向进行克隆

C.为了能同时进行表达，基因h 和B 要位于同一开放阅读框中

D.为了维持质粒在细菌中的稳定存在，必须在培养基中添加氨苄青霉（ampicillin）

为了表征H 和B 蛋白的寡聚状态，准备如下3 个蛋白样品：1）H 蛋白；2）从上述实验中得到的H 和B 蛋白；3）B 蛋白。 样 品1 和样品2 是透明的，但样品3 中大部分蛋白质发生沉淀。 将样品1和样品2 分别通过凝胶过滤柱。 所获得的蛋白分离谱如图1.6A 所示。不同大小参照分子在凝胶过滤柱上的分离如图1.6B 所示。

图1.5 P1 表达载体详细的限制性图谱

图1.6 H 和B 蛋白的凝胶过滤分析

问题1.7 （4 分）

计算样品1 和样品2 中， 蛋白所对应凝胶过滤峰的相对大小，填写在下表中。

样品 分子量（kDa）样品1 中观察到的峰样品2 中观察到的峰

问题1.8 （4 分）

判断下列陈述的正确与错误。 在答题卡上用“√”表明正或误。

A. H 蛋白以单体的形式存在

B. H 和B 可能以异源二聚体形式存在

C. H 蛋白有助于B 蛋白的稳定存在

D. 在非变性凝胶过滤柱分析中，一个蛋白质的保留时间和它们的分子量大小成正比

实验2 咖啡提取物的抗氧化活性（30 分）

介绍：生物氧化产生活性氧自由基，可造成细胞严重损坏。抗氧化剂是能清除自由基，从而抑制氧化反应的分子。 抗氧化剂包括还原剂如硫醇化合物，抗坏血酸及酚醛等。咖啡通过烘焙咖啡豆制备，是抗氧化剂的一个潜在来源。

在2，2-diphenyl-l-picrylhydrazyl（DPPH）清除实验中，DPPH 的量被不断减小， 从而失去其紫色。SC50值（清除能力）通常用于抗氧化活性的评估。 此值表示清除50%的DPPH 自由基所需样品的浓度。

DPPH 吸收率可以在517 nm 波长处测定。 假设空白的吸光度可忽略不计。 对照组（无清除剂，Ac）和样品（As）的吸光度将用于计算不同浓度样本的清除率（SC%）：

SC（%）=（Ac-As）×l00／Ac

根据一系列样品中不同浓度和相应的清除百分比的对数，可以做图并从中计算获得SC50值。

本实验将研究一个越南咖啡品种（Coffea canephora）的抗氧化活性。 咖啡豆粉混合物（1 g）在80℃下，悬浮于去离子水中30 min，然后过滤。 加入去离子水，将萃取液的总体积定量为200 mL。

实验步骤和问题：

图2.1 96 孔微量培养板

上面的96 孔微量培养板可用于开展系列稀释实验。 微孔板上孔的位置由一个代表行的字母（A～H）和一个代表列的数字（1～12）表示。

·使用微量移液器制备4 个抗坏血酸溶液（AA1-AA4， 分别位于A1-A4 孔中） 和4 个咖啡萃取液溶液（CC1-CC4，分别位于A6-A9 孔中）。每个溶液都是2 倍稀释。 抗坏血酸和咖啡提取液最低浓度分别是0.025 mg/mL 和0.625 mg/mL。每个孔中的溶液在稀释前都是200 mL。

注意：如果在加样过程中不慎发生错误，可以将抗坏血酸溶液和咖啡萃取液溶液分别放置到孔H1-H4（AA1-AA4）和H6-H9（CC1-CC4）。

问题2.1 （4 分）

将你准备抗坏血酸和咖啡提取物的稀释计算填入下表中。

稀释液 AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4用于稀释溶液的体积（滋L）H2O（滋L）的体积浓度（mg／mL） 0.025 0.625

·从行A 各个孔内的抗坏血酸溶液和咖啡提取物溶液中分别移取20 滋L， 放置到行B、C 和D的相应孔内。如果在此步骤中不慎发生错误，可在行E、F 和G 中重复上述操作。

·在孔B11、C11 和D11 中各加入20 滋L 水。

·在步骤2 和3 中准备的孔内，各加入180 滋L的DPPH 溶液。

·将盖子盖好96 孔板，在室温下孵育10 min。请设置定时器计时。

完成此步骤后，请举起绿卡。请助理帮助你用酶标仪测定吸光度，并返回你打印好的输出数据。

问题2.2 （5 分）

计算抗坏血酸和咖啡萃取物浓度的对数值（log10），并填入答题卡上的表格内（所有数字四舍五入至2 位小数）。 你可根据下列步骤，使用计算器计算对数值：

·按ON 键，打开计算器。

·按4 个键：“SHIFT”键、“CLR”键、“2”键、“=”键返回到计算模式。

·按“log”键。

·输入数字。

·按“=”键。

计算每个稀释的平均吸光度、 每个样品的清除率并填入下表。

溶液 对照AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4 Log10 浓度（mg／mL）平均吸光度SC%

问题2.3 （5 分）

Log10 浓度（mg／mL）

使用计算值， 在答题卡上给出的网格线中绘制清除率对应抗坏血酸浓度的对数（log10）的线性曲线。

问题2.4 （5 分）

计算抗坏血酸和咖啡提取物的SC50值，并填入答题卡上表格中（你可以利用问题2.3 中的格子对咖啡萃取液作一条线性曲线，但该曲线并不算分）。

抗坏血酸 咖啡萃取物SC50

问题2.5 （3 分）

使用相同的方法， 某2 个咖啡品种提取物的SC50的值如下：

咖啡提取物 SC50 X 3.8 mg／mL Y 2.6 mg／mL

比较包括本实验中咖啡豆（Z）的抗氧化活性，依据从强到弱的顺序， 把不同类型的咖啡豆填入下表的空格处。

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问题2.6 （4 分）

假设你在实验中发现不同稀释度的咖啡提取物和DPPH 混合物的吸光度非常接近， 差异可忽略不计。 请判断下列陈述是正确还是错误，用“√”表明。

A.稀释后的咖啡提取物的抗氧化活性可以忽略不计

B.为了更准确地测定抗氧化活性，需要利用更高浓度的样品进行另外的实验

C.咖啡提取物中存在的抗氧化酶的活性导致了上述结果

D.如果孔中存在NADH 污染，其结果将类似于上述假设

问题2.7 （4 分）

一个学生使用和你一样的方法（方法A）测定了一个样品的抗氧化活性。与此同时，他又使用了另一不同方法（方法A*）进行测量。他所得的结果如下：

方法A 方法A*SC50（mg／mL） 1.95 3.9

下列哪些变化可能导致更高的SC50值？ 请判断下列陈述是正确还是错误，用“√”表明。

A.该学生在方法A*中可能使用了0.1 mm 的DPPH

B.该学生在方法A*中可能使用了10 μL 的样品

C.加入DPPH 后，该学生将96 孔板孵育的时间可能比方法A 中的短

D.该学生可能使用了对抗氧剂更好的溶剂

实验3 乳酸发酵（30 分）

介绍：近日，科学家分离出越南传统发酵芥菜同型酸乳酸杆菌菌株（Lactobacillus sp. VN156）。在该实验中， 乳酸杆菌VN156 在MRS 培养基中生长。 培养基的初始pH 为5.6。 在培养过程中的不同时间点取样， 测定细菌在600 nm 的光密度（OD）（图3.1）。 样品A0、A2、A3 和A5 是所收集菌液的上清液，将用于分析乳酸的浓度。

图3.1 乳酸杆菌VN156 的生长曲线

问题3.1 （3 分）

假设图3.1 表示生长的真实过程。 计算乳酸杆菌VN156 在指数生长期的增代时间（h），将数值填入答题卡中。

问题3.2 （3 分）

如果将1 mL，培养9 h 后的菌液稀释到新鲜的MRS 培养基中，计算培养6 h 后的细菌细胞数量，记录在答题卡中。

pH 计的校准。

使用便携式pH 计（图3.2）测量pH 值。

图3.2 便携式pH 计

步骤1）按照图3.3 中以下步骤校准pH 计。

·拨动ON／OFF 按钮，打开pH 计。

·取下保护盖，用清水冲洗电极尖，轻轻地用纸巾擦干。

·将电极头部浸入pH 值7.01 的缓冲溶液中。 确保电极末端完全浸没在溶液中（约2 cm 的末端在溶液中）。 等待读数稳定。

·用螺丝刀， 轻轻旋转pH7 微调螺丝， 直到屏幕上显示pH 值为7.01。

·用水冲洗pH 电极，轻轻地用纸巾擦干。

·将电极头部浸入pH4.01 的缓冲溶液中。等待读数稳定。

·用螺丝刀，轻轻旋转pH4／10 微调螺丝，直到屏幕上显示pH 值为4.01。

·校准完成。

·注意：如果你关闭pH 计，再次打开使用前应重新校准。

图3.3 校准pH 计

乳酸滴定：滴定是一种分析技术，可对溶解在溶液中的特定物质（分析物）进行定量测定。 它基于添加到溶液中、浓度已知的分析物和试剂（滴定剂）之间完全化学反应。 在这一部分实验中，将通过滴定方法，用0.1 mol/L 的氢氧化钠确定样品中的乳酸浓度，如图3.4 所示。

图3.4 滴定装置

问题3.3 （2 分）

根据问题3.2 的结果计算所需样品（mL）和水（mL）的体积，并填入下表中。

培养时间（h）样品稀释因子样品体积（mL）去离子水的体积（mL）总体积（mL）0 A0 2 30 6 A2 5 30 9 A3 10 30 15 A5 20 30

·根据你的计算，在100 mL 的烧杯中对每个样品配制稀释液。每个样品准备2 个重复样品。请使用25 mL 的量筒移取去离子水，使用微量移液器和10 mL 的量筒中移取样品。

·将一个磁性搅拌棒小心地放入稀释的样品溶液中。 夹紧pH 计，让电极末端处于溶液中（约2 cm 的末端浸没在溶液中）， 同时保证在搅拌的过程中搅拌子不会碰到pH 电极。 开始进行缓慢搅拌并记录0.1 mol/L NaOH 溶液的起始体积。

·小心拧动滴定管的活塞，让NaOH 溶液从管中缓慢滴入烧杯里的样品中。 当pH 样品变为中性（6.95～7.05）时，停止加入NaOH。 记录0.1 mol/L NaOH 溶液的剩余终体积。

·每次滴定完成后， 小心地从溶液中取出pH电极，用清水冲洗。用钳子取出搅拌子并用水冲洗。

·针对每个样本，重复步骤2～5。

问题3.4 （9 分）

记录用于每个样品滴定的0.1 mol/L 氢氧化钠的体积，记录在下表中。

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问题3.5 （10 分）

计算滴定每个样品，30 mL 储备所需0.1 mol／L NaOH 的平均体积。 计算每个样品中乳酸菌浓度。在下表中记录所有数据。

培养时间（h） 样品 滴定30 mL 储备样品用0.1 mol／L NaOH 的体积（mL）乳酸产量（g／L）0 A0 6 A2 9 A3 15 A5

问题3.6 （3 分）

基于图3.1，假设OD600=1 对应于细胞浓度2×108个细胞/mL。 细菌细胞的数量增加2×108个细胞／mL， 乳酸的浓度将增加1g/L。 如果培养11 h后的乳酸浓度为6 g/L，计算细菌细胞的数量（细胞／mL），并记录在答题卡中。