青海血蜱传斑点热群立克次体带菌率及遗传进化分析

杨菊凤 ,刘琴华 ,杜迎春 ,李秀丽 ,田慧丽 ,郭瑞萍 ,温青娜

(1.山东畜牧兽医职业学院动物科技系,山东潍坊261061 ;2.河南科技学院高等职业技术学院,河南新乡453646 ;3.北京市水生野生动植物救护中心,北京延庆 102100)

立克次氏体(Rickettsia)是一类大小介于细菌和病毒之间,且更接近于细菌的一类原核微生物,该类微生物革兰染色阴性,专性寄生于真核细胞的原核单细胞微生物,为纪念发现洛杉矶斑点热病原体的美国医生Howard Taylor Ricketts 而命名[1]。立克次体属(Rickettsia)的立克次体分为2 个群,即斑疹伤寒群立克次体(Typhus GroupRickettsiae)和斑点热群立克次体(Spotted Fever GroupRickettsiae,SFGR)[1-3]。我国于1958 年首次在血清学上证实了斑点热群立克次体的存在;并于1962 年从黑龙江虎饶地区东方田鼠(Microtus fortis)体内首次分离到了斑点热群西伯利亚立克次体(R.siberian)[1]。蜱是一类重要的医学节肢动物,专性寄生于哺乳类、爬行类、鸟类等动物的体表。蜱传斑点热群立克次体疾病是一类由蜱传播的自然疫源性疾病,由于动物宿主的存在,它们在某一地区长期存在和流行,人进入疫源地就可能被蜱叮咬而感染发病[4-5]。目前我国西北部省区优势媒介蜱种传斑点热立克次体的遗传变异及其多样性研究较少,是否存在新的SFGR 变种尚需详实的分子流行病学资料。在此我们采用PCR 方法扩增青海省优势蜱种青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)携带斑点热群立克次体的外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因,并构建分子系统发育树进行斑点热群立克次体的遗传进化分析,以明确青海血蜱斑点热群立克次体带菌率及遗传进化规律,为制定蜱传斑点热的有效防治措施提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 青海血蜱标本采集及种类鉴定 我们于2013年5 月-2014 年10 月,在青海省天峻县的新源镇、阳康乡、龙门乡、快尔玛乡和舟群乡等5 个乡镇的放牧牛、羊体表及野外生境中进行青海血蜱标本采集。在进行放牧牛、羊体表蜱标本采集的时候用镊子轻轻夹取蜱虫,小心拔下,防止蜱虫头节断裂在动物皮肤内,或用点燃的香烟头灼烫蜱虫臀部,待其自行从动物体表离开,用镊子夹取,放进装有昆虫保存液的青霉素小瓶。我们采用布旗法进行野外生境中青海血蜱标本的采集。手持布旗在野外生态环境中拖拽布旗,行走50 m 左右时,翻转布旗,查找布旗表面的爬行蜱虫,用镊子夹取,放进装有昆虫保存液的青霉素小瓶夹取蜱标本放入盛有昆虫保存液的采集瓶中[6-7]。

1.2 青海血蜱基因组DNA 提取 先将采集到的青海血蜱标本进行75%酒精消毒,然后无菌PBS 洗涤3 次,滤纸吸干。将采集的3～8 只未饱血或1～3只饱血的蜱标本作为一个样品池于白色乳钵内,加液氮研磨至粉末后移入1.5 mL 离心管中。采用商业化的基因组提取试剂盒提取基因组(北京元和医疗科技有限公司),-20 ℃保存备用[5]。

1.3 SFGROmpA基因PCR 扩增 根据已发表文献SFGR 190 kDOmpA基因合成引物序列。引物序列为:SFGR-F:5′-ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA-3′;SFGR-R:5′-GTT CCG TTA ATG GCA GCA TCT-3′,目的片段长度约为631 bp (Rr190.70 p/Rr190.701 n),上述引物序列由英潍捷基公司合成[5-6]。PCR 反应体系(50 μL):SFGR-F(10 pmol/mL)和SFGR-R(10 pmol/mL)引物各1 μL;DNA 模板1 μL;2×TaqPCR Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)25 μL;无RNA 酶H2O 22 μL。反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃终延伸10 min。在本PCR反应中我们同时设置阴性及阳性PCR 对照反应,以无菌PBS 为阴性对照,以感染SFGR 的蜱标本DNA(来源于中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)为阳性对照。

1.4 序列测定及分子系统进化树分析 取SFGROmp A基因PCR 扩增产物10 μL 进行琼脂糖电泳;取经电泳检测阳性PCR 产物50 μL 送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序;双向测序结果经DNA STAR 软件包EDIT 程序编辑拼装后,与GenBank 中发表的SFGROmp A基因序列进行序列一致性比对分析,然后利用DNA MAN 及MEGA 6.06 进行SFGR 同源性及遗传进化分析。

2 结果

2.1 PCR 电泳结果 我们于2013 年5 月-2014年10 月在青海省天峻县的5 个乡镇的放牧牛、羊体表及野外生境中进行青海血蜱标本采集。在本次调查中我们共采集了5 个乡镇的23 个牛、羊养殖场及牛、羊放牧的野外生境蜱标本,经蜱形态学鉴定共收集青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)1 548只,分为316 个青海血蜱标本样品池。经SFGROmpA基因PCR 检测,在316 个青海血蜱标本样品池中共检测到31 个样品的阳性电泳条带,与预期SFGROmpA基因电泳条带位置一致,青海省天峻地区青海血蜱SFGR 带菌率为9.8%。见图1。

图1 PCR 扩增SFGR ompA 基因(约631 bp)

2.2 序列测定与结果分析 我们对本试验检测到的31 个阳性SFGR 样品的OmpA基因进行双向测序,序列一致性比对分析结果显示,本试验获得的31 个SFGROmpA基因序列一致性为100%。我们选取样品编号为TJ013 的阳性样品SFGROmpA基因序列进行GenBank Blast 分析,并选取GenBank 中的SFGROmpA基因序列建立分子遗传进化树进行遗传进化分析,结果显示,TJ013 与立克次体福建分离株FUJ98(AF169629)处于同一分支;黑龙江立克次体HL-93(AF179364)及HL-054(AF179362)与日本立克次体YM(U43795)处于一个分支;且上述两个分支又处于一个较大的分支。SFGROmpA基因序列同源性分析结果显示,TJ013 与立克次体福建分离株FUJ98(AF169629)同源性最高,为95.49%;与其他斑点热群立克次体的同源性小于95%,其中与黑龙江立克次体绥芬分离株HLJ-054 和虎林分离株HL-93 的同源性均为91.44%;和日本立克次体YM 同源性为90.24%,同一分支中同源性最低。

图2 斑点热群立克次体OmpA 基因遗传进化分析

3 讨论

2006 年我国首次报道了安徽省芜湖10 例无形体病确诊病例,其中1 例死亡[8-9]。2007 年5 月-2010 年9 月期间,河南省共监测和报告蜱虫叮咬后出现发热伴血小板减少综合征、疑似无形体病病例557 例,其中18 例死亡。2011 年通过序列非依赖核酸扩增技术结合电子显微镜形态学分析,初步确定通过蜱虫导致18 人死亡的病原为布尼亚病毒科白岭病毒属的一种新病毒,命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),本病毒由蜱进行传播,但其媒介蜱种范围还不十分明确,导致了严重的公共卫生问题[10]。蜱传斑点热群立克次体(SFGR)疾病是一类由蜱传播的斑点热群立克次体中病原性立克次体引起的[11],以急性发热和皮疹为主要症状的自然疫源性疾病。该群立克次体为专性细胞内寄生微生物,蜱、螨为其保存宿主,可经期、经卵垂直传递立克次体,保持其种群的连续性。此外,由于动物宿主的广泛存在,它们在某一地区长期存在和流行,人进入疫源地就可能被蜱叮咬而感染发病。青海血蜱作为我国西北部地区特有的、优势的蜱种,探究青海血蜱SFGR 带菌率具有十分重要的公共卫生意义。

本试验通过分子生物学和生物信息学的方法,对青海省天峻地区青海血蜱斑点热群立克次体带菌率进行分子流行病毒调查及流行菌株的遗传进化分析和鉴定。结果显示,在316 个青海血蜱标本样品池中共检测到31 个样品的阳性电泳条带,与预期SFGROmpA基因电泳条带位置一致,青海省天峻地区青海血蜱SFGR 带菌率为9.8%。与以往的研究相比,青海血蜱SFGR 带菌率高于河北省长角血蜱SFGR 的带菌率(6.9%～7.42%),寄生蜱种的差异可能是SFGR 带菌率差异的主要原因[4-5,11]。

OmpA和OmpB基因是编码SFGR 外膜蛋白的基因,其中OmpA基因是SFGR 的特异性外膜蛋白基因,不同种SFGR 的外膜蛋白编码基因OmpA表现出种的差异性,对斑点热群立克次体的基因型或其亚型鉴定及分类具有重要意义。此外,OmpA基因还可以准确把握SFGR 的遗传变异特征。在本试验中我们通过构建SFGROmpA基因分子系统进化树及基因序列一致性分析,获得的31 个SFGROmpA基因序列一致性为100%,因此我们选取TJ013 作为代表菌株进行后续的遗传进化分析;遗传进化分析表明,TJ013 与立克次体福建分离株FUJ98(AF169629)处于同一分支;黑龙江立克次体HL-93(AF179364)及HL-054(AF179362)与日本立克次体YM(U43795)处于一个分支;且上述两个分支又处于一个较大的分支。提示东亚地区斑点热群立克次体的外膜蛋白OmpA基因变异不大,亲缘关系较近。但是SFGROmpA基因序列同源性分析结果显示,TJ013 与立克次体福建分离株FUJ98(AF169629)同源性最高,为95.49%;与其他斑点热群立克次体的同源性小于95%,其中与黑龙江立克次体绥芬分离株HLJ-054 和虎林分离株HL-93 的同源性均为91.44%;和日本立克次体YM 同源性为90.24%,同一分支中同源性最低。提示我们本次检测到的斑点热群立克次体可能是一个新种,且与福建立克次体具有较高的渊源,可能因为是全球气候变暖使得热带地区范围扩大,一些原先仅限于该地区的病毒、细菌、寄生虫等也出现在温带甚至寒带。也有可能随着人口的快速增长,人类活动区域不断向蜱虫栖息地扩展,逼迫蜱虫迁移,将“毒”带入新的区域环境,在气候和地理生态环境的双重作用下引起核酸序列部分碱基的变异,导致斑点热群立克次体新种的形成。

通过本次对青海省天峻地区青海血蜱SFGR 带菌率的分子流行病学调查,明确了青海血蜱SFGR的带菌率;遗传进化分析显示本次检测到的SFGR可能为一新种立克次体,为蜱传斑点热的防控提供基础科学依据。