CHD-PAH患儿CFHR2、T-bet mRNA、CF6的变化及其意义

杨慧敏

(郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院，心血管内科，河南 郑州450000)

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）相关的肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）的发生，能够增加患者的恶性心血管结局事件的发生风险，导致患者临床转归的恶化[1]。流行病学研究提示，PAH的发病率可达252～363/10万人左右[2]。

不同的因素或者生物学因子的改变，能够通过加剧氧化应激反应、促进肺动脉血管内皮的损伤等，促进肺动脉高压的发生。补体因子H相关蛋白 2 （complement factor H related protein 2，CFHR2）及外周血单核细胞转录因子T-bet mRNA的表达，能够通过对趋化因子富集的影响，抑制补体成分对于肺动脉内皮下平滑肌细胞增殖的促进作用，降低肺动脉的狭窄和肺动脉高压的形成风险[3]；偶联因子-6（coupling factor-6 CF6）的表达，能够促进血管收缩性因子的释放，增加内皮素等对于平滑肌的痉挛作用，导致血流灌注阻力的增加[4]。为了进一步评估CHD-PAH患儿CFHR2、T-bet mRNA、CF6的变化，从而为临床上PAH患者的肺动脉高压病情评估提供参考，本次研究选取我院2014年2月-2017年5月收集的CHD-PAH患儿60例，探讨了不同指标与患者肺功能的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2014年2月-2017年5月收集的CHD-PAH患儿60例 （CHD-PAH组）、CHD未合并PAH患儿70例（CHD组）。CHD-PAH组，患儿年龄 12～54个月，平均 35.2±11.0个月，男34例、女26例；其中室间隔缺损33例、房间隔缺损 27 例；PAH 程度：轻度组（PAH：30～40mmHg）21例、 中度组 （PAH：40～70mmHg）24 例、 重度组（PAH：＞70mmHg）15 例。 CHD 组，患儿年龄 12～60个月，平均 38.0±13.2个月，男39例、女 31例；其中室间隔缺损38例、房间隔缺损32例。两组患者的年龄、性别、CHD类型比较，差异无统计学意义，具有可比性。纳入标准：⑴CHD及PAH的诊断标准参考中华医学会制定的标准[5]；⑵患者年龄1～5岁；⑶经超声心动图、彩色多普勒超声检查确诊；⑷PAH患儿的肺动脉高压＞30mmHg；⑸本研究获得患儿家长的知情同意。排除标准：⑴合并恶性肿瘤；⑵由已知其他病因导致肺动脉高压；⑶伴有造血系统疾病、免疫系统疾病；⑷近期使用激素类药物治疗。

1.2 指标检测方法 CFHR2、CF6的检测：采用化学发光法检测CFHR2，检测仪器为MAGLUMI化学发光免疫分析仪及其配套试剂。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测CF6，检测仪器为美国Bio-Bad全自动酶标仪，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书操作。

T-bet mRNA的检测：采集血液5ml，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)，反复一次洗涤 RNA，弃上清，在管底部可见一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入HPV基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其终浓度均为20pmol/ul，制备反应体系，RT-PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共40个循环；循环完毕后68℃延伸7min。

1.3 统计学方法 数据统计分析采用SPSS 16.0软件，采用（±s）表示计量资料，两组间比较采用成组设计t检验、三组间比较采用单因素方差分析法、手术前后对比采用配对t检验；计数资料比较采用χ2检验；P值＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较 CHD-PAH患儿的血清CFHR2、T-bet mRNA水平显著的低于CHD组患儿，差异具有统计学意义（P＜0.05）；CHD-PAH 患儿的 CF6 水平显著的高于CHD组患儿，差异具有统计学意义（P＜0.05）；见表 1。

表1 两组患儿的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较（±s）

表1 两组患儿的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较（±s）

组别 n CHD-PAH组CHD组t值P值60 70 CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 76.1±22.9 160.3±48.4 12.339＜0.001 242.9±66.0 184.0±43.5 6.084＜0.001 6.93±0.58 7.40±0.62 4.438＜0.001

2.2 不同PAH病情患儿的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较 轻度、中度CHD-PAH患儿的血清CFHR2、T-bet mRNA水平显著的高于重度CHD-PAH 组患儿（P＜0.05）；轻度、中度 CHD-PAH患儿的CF6水平显著的低于重度CHD-PAH组患儿（P＜0.05）；轻度 CHD-PAH 患儿的血清 CFHR2、T-bet mRNA水平显著的高于中度CHD-PAH组患儿（P＜0.05）；轻度CHD-PAH患儿的CF6水平显著的低于中度CHD-PAH组患儿 （P＜0.05）；见表2。

表2 不同PAH病情患儿的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较（±s）

表2 不同PAH病情患儿的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较（±s）

PAH程度 n轻度中度重度F值P值21 24 15 CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 114.8±21.8 73.0±18.4 45.6±17.2 33.092＜0.001 194.2±61.4 238.8±55.0 311.2±59.1 29.817＜0.001 7.31±0.55 6.94±0.53 6.40±0.47 13.372＜0.001

2.3 CHD-PAH患儿手术前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较 手术后1周，CHDPAH患儿的血清CFHR2、T-bet mRNA水平显著的较术前升高（P＜0.05）；CF6水平较手术前显著的降低（P＜0.05）；见表 3。

表3 CHD-PAH患儿手术前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较（±s）

表3 CHD-PAH患儿手术前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比较（±s）

时间 n手术前手术后1周t值P值CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 76.1±22.9 121.6±34.0 8.598＜0.001 242.9±66.0 193.0±31.8 5.276＜0.001 6.93±0.58 7.32±0.44 4.150＜0.001

2.4 CFHR2、CF6及 T-bet mRNA的诊断学分析血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平鉴别诊断CHD-PAH患儿与CHD患儿的ROC曲线下面积AUC 值分别为 0.837、0.747、0.706。 见图 1。

图 1血清 CFHR2、CF6及 T-bet mRNA水平鉴别诊断CHD-PAH患儿与CHD患儿的ROC曲线

3 讨论

先天性心脏病血流动力学和心脏血管的结构的改变等均能够促进PAH的发生，甚至导致患者多器官功能衰竭的发生[6，7]。长期的临床回顾性分析研究显示，现阶段临床上PAH患者的治疗总体有效率、治疗后的再次入院率等指标仍然较高，远期的心力衰竭的发生率仍然超过15%[8，9]。同时临床上缺乏对于PAH患者肺功能评估的指标，虽然动脉血气分析能够为肺动脉高压的病情评估提供参考，但其属于有创检查，且费用较高。本次研究对于CFHR2、CF6及T-bet mRNA等指标的相关研究，不仅能够为PAH患者的生物学治疗提供潜在的治疗靶点，同时还能够为PAH患者的肺动脉高压的病情评估提供血清学参考。

CFHR2对于补体成分的调控作用，能够抑制下游C4、C3成分的激活，减轻其对于患者肺动脉血管内皮细胞的损伤，抑制内皮细胞的凋亡。近年来基础领域的研究提示，CFHR2能够抑制单核细胞对于动脉血管内皮的浸润，降低血管内皮持续性病变的风险；T-bet mRNA作为核因子转录的重要调控因素，其能够通过抑制肺动脉内皮细胞核转录上游启动子的激活，减少血管内皮下组织的纤维化改变。T-bet mRNA还能够通过稳定MAPK信号通路，降低MAPK激活导致的动脉管壁的重塑性改变[10，11]；CF6能够诱导内皮素的分泌，降低一氧化氮的合成和释放，导致动脉的持续性痉挛，增加动脉血的血流动力学指标的紊乱，促进肺动脉高压的发生[12]。部分研究揭示了CFHR2、T-bet mRNA、CF6在PAH患者中的差异性表达情况，认为CFHR2等的下降是促进PAH发生的重要因素，但缺乏对于不同指标与肺动脉高压程度的关系分析。

本次研究对于血清中不同指标的分析可见，CFHR2、T-bet mRNA、CF6在 PAH 患者中均存在明显的异常表达波动，其中CFHR2、T-bet mRNA的表达浓度明显下降，而CF6的表达浓度明显上升，提示了 CFHR2、T-bet mRNA、CF6 等均影响到了PAH患者肺动脉高压的病情进展。从原因上分析，相关指标对于患者肺动脉高压的影响主要包括下列几个方面[3，13]：⑴CFHR2、T-bet mRNA 的上升能够抑制肺动脉平滑肌间质细胞的纤维化和脂肪化；⑵CF6的上升能够影响肺动脉血管内皮细胞的功能，导致局部血流呈现出明显的“高阻力、低灌注”的现象。张茜等[14]研究者发现肺动脉高压患者血清中的异常表达情况，CFHR2的表达浓度可平均下降25%以上，同时患者的肺动脉高压越为严重，CFHR2的表达浓度下降越为明显。在肺动脉病情越为严重的患者中，CFHR2、T-bet mRNA的下降程度越高，而CF6的上升幅度越为明显，这些均提示了 CFHR2、T-bet mRNA、CF6与患者肺动脉高压的直接关系，CFHR2等能够通过抑制肺动脉血管的重塑，稳定动脉血压，从而降低肺动脉血压的波动程度[15]。但部分学者并不认为CFHR2等的表达与PAH患者的肺动脉高压具有线性的关系，不同研究间存在不同的结论，考虑主要由于不同指标的监测时机、不同PAH的肺动脉高压评估方式的差别有关。最后本次研究发现在治疗后的患者中，相关指标的表达呈现出了进一步的波动，其中治疗后的CFHR2、T-bet mRNA有所恢复，而CF显著下降，进一步提示了CFHR2、T-bet mRNA、CF6等指标与PAH患者的病情关系。诊断学分析研究可见，CFHR2、CF6及T-bet mRNA在单独诊断肺动脉高于的过程中均具有一定的价值，其中CFHR2单独诊断的AUC下曲线面积较大，提示了CFHR2在单独诊断疾病的过程中具有较高的参考价值。

综上所述，CHD-PAH患儿血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA较单纯CHD患儿发生显著的改变，并且与肺动脉高压严重程度具有一定的关系。