猪流行性腹泻免疫抗体的ELISA检测及其与琼脂扩散试验相关性分析

潘孝成，芮聪杰，沈学怀，赵瑞宏，戴 银，胡晓苗，侯宏艳，周学利，张丹俊

（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031；3.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230061）

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链有囊膜的RNA病毒，其可导致猪的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的传染病，尤其哺乳仔猪受害最严重，1971年首次在英国发现猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）[1]，我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[2]，2010年底开始，PED在我国呈暴发性流行，2011—2012年流行面积进一步扩大，疫情继续蔓延，一些地区流行较为严重[3-5]，2013年、2014年猪流行性腹泻更是肆虐全球，美国、墨西哥、中国台湾、日本、加拿大、多米尼加共和国、哥伦比亚、秘鲁、韩国、乌克兰等国家和地区也相继暴发猪流行性腹泻疫情[6-7]，给世界养猪生产者造成巨大的经济损失。近年来猪流行性腹泻在我国呈现常态化，在秋、冬、春季十分常见，其危害仍然较重[8]。

目前，我国对猪流行腹泻的防控主要是采用疫苗免疫，市场上的商品化疫苗主要有猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗和活疫苗以及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒病三联活疫苗3种，其中所用猪流行性腹泻病毒的毒株不尽相同，各家猪场对猪流行腹泻的免疫采用疫苗和免疫程序也不完全相同。本研究对不同地区的5家规模猪场的母猪初乳的猪流行性腹泻病毒IgA抗体水平进行了ELISA检测分析，并对流行性腹泻病毒抗体的ELISA和琼脂扩散试验（琼扩试验）检测结果的相关性进行了研究，旨在为猪流行性腹泻防控提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年1—3月在安徽省农业科学院畜牧兽医所/安徽省畜禽疫病研究中心进行。

1.2 主要试剂和材料

猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测试剂盒，韩国安捷公司Bionote公司生产（生产批号：EB4410PO）；猪流行性腹泻病毒琼扩抗原，安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室制备并保存。

1.3 样本采集和处理

采集免疫过猪流行性腹泻疫苗的母猪初乳样本，用1.5 mL高压灭菌消毒离心管自哺乳期母猪身上采集产后3 d内的初乳样本，每头猪采集不少于500 μL乳汁，共采集样本数为454份，来自5家大规模猪场，分别是河南省漯河市源汇区和信阳市平桥区的2家猪场，安徽省定远县和肥东县的2家猪场，江苏省泗洪县的1家猪场。将乳汁样本4℃12 000 r/min离心3 min，取上清液，低温保存备用。

1.4 ELISA检测

按照猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测试剂盒说明书，对所有采集母猪初乳的PEDV IgA抗体进行检测。1）检测的有效性：阴性对照平均OD450值（NCX）≤0.200，阳性对照平均 OD450值（PCX）≥0.500，上述任何一个值超出规定的范围，则该试验被视为无效，所检的样品需要重新进行检测。2）判断值=0.35+NCX。3）阳性结果：样品OD450值＞判断值；阴性结果：样品OD450值＜判断值。

1.5 琼扩检测

用浓度0.01 mol/L、pH为7.4的PBS配制浓度1%的琼脂糖凝胶，制备琼扩平板，琼脂糖凝胶厚度为5～6 mm之间，用七孔梅花打孔器打孔。将琼扩抗原加入到7孔中的中间孔，将待测抗体做等比稀释，稀释倍数分别为 2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6，依次加入到周围 6 孔中，加入琼扩抗原和待测抗体的量均为30 μL/孔，将琼扩平板于37℃温盒中反应24 h，读取琼扩抗体效价。

2 结果

2.1 不同猪场母猪乳汁中IgA抗体水平

收集来自河南、安徽、江苏的5家大型猪场454份初乳样本，将猪场分别命名为AK、XHZ、BD、MQ、NA，这5家猪场生产母猪免疫猪流行性腹泻疫苗次数，除BD场为产前3次，其余为产前2次（4/5），见表1，不同猪场所用疫苗生产厂家和疫苗毒株也不尽相同。用猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果显示，5家猪场初乳中PEDV IgA抗体阳性率均较高，阳性率分别为94.00%、97.06%、98.00%、98.21%和100%，阳性率最高的是XHZ场，最低的是MQ场。XHZ和MQ场其母猪免疫次数相同，产前的第1次免疫时间不同；XHZ用的是PEDV活疫苗和灭活苗的组合；MQ全部用的是灭活苗免疫。5家猪场初乳中PEDVIgA抗体阳性平均OD450值分别为1.858 8、1.979 0、2.013 6、2.047 3和2.148 0，差异不显著（P＞0.05），PEDV IgA抗体阳性平均OD450值最低的是生产母猪免疫次数最多的BD场，最高为AK场，见表2。

表2 不同猪场母猪初乳中PEDV IgA抗体ELISA检测结果

2.2 ELISA与琼扩相关性检测结果

为建立PEDV抗体的ELISA与琼扩检测相关性，选择ELISA检测为PEDV IgA抗体阳性的初乳样本，按OD450值大小分组用琼扩法检测PEDV抗体并分析，所用PEDV琼扩抗原为本实验室制备的高浓缩纯化抗原，每组检测初乳样本数为5个或6个。结果显示，OD450值≤1.0的组别琼扩抗体检测全部为阴性，OD450值为 1.1～1.4、1.5～1.8、2.1～2.7 和≥3.0的4个组别所测得琼扩几何平均效价分别为1∶4.5、1∶12.1、1∶32 和 1∶36.8，可以看出抗体琼扩几何平均效价与PEDV IgA ELISA抗体检测试剂盒检测所得的OD450值存在正相关性，即ELISA检测OD450值高的，其琼扩几何平均效价则相对较高。具体见表3。

表3 乳汁PEDV抗体的ELISA与琼扩相关性检测结果

3 讨论

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，各种年龄的猪都能感染发病，尤其哺乳仔猪受害最严重，发病率可达100%，病死率平均为50%，10日龄内哺乳仔猪死亡率可高达90%，断奶猪、肥育猪、母猪和种公猪虽然发病率也可达100%，但大多数病猪可康复，一般表现为持续4～6 d的水样腹泻，基本不出现死亡[3，9]。大量研究表明，初生仔猪主要通过母猪初乳中IgA抗体而获得PED的被动免疫保护，因此母源抗体中IgA抗体水平高低对保护初生仔猪抗PEDV感染极为关键[10-11]。

本研究对来自安徽、河南、江苏的5家大型猪场免疫母猪初乳中PEDV IgA抗体水平进行了检测，初乳抗体阳性率均较高，阳性率为94.00%～100%，阳性样品平均OD450值分别为1.858 8～2.148 0。从结果分析可知，生产母猪的免疫次数、疫苗种类和疫苗生产厂家对生产母猪初乳中PEDV IgA抗体水平无明显影响。胡兴义等[10]研究表明，产前采用猪流行性腹泻三联活疫苗和二联灭活疫苗交替免疫的方式，比产前均用猪流行性腹泻三联活疫苗或二联灭活疫苗进行两次免疫效果更好。王艳丰等[11]研究表明，生产母猪产前猪流行性腹泻三联活疫苗和二联灭活苗组合使用，其初乳抗体平均阳性率（97.79%）高于生产母猪产前猪流行性腹泻二联灭活疫苗二次免疫组（90.69%）。结合本研究及胡兴义等[10]、王艳丰等[11]研究结果，我们认为生产母猪产前进行一次猪流行性腹泻活疫苗（猪流行性腹泻三联活疫苗或猪流行性腹泻二联活疫苗）加一次猪流行性腹泻二联灭活疫苗免疫，这可能是较为合理的猪流行性腹泻产前免疫方式。

琼脂扩散试验是一种常用的抗体检测方法，其具有操作简便、成本低廉和仪器设备要求低等特点，适宜于基层兽医和养殖场等使用。本研究结果表明抗体琼扩几何平均效价与PEDV IgA ELISA抗体检测试剂盒检测所得的OD450值呈正相关性，虽然PEDV IgA ELISA检测阳性且OD450值≤1.0的组别琼扩抗体检测全部为阴性，但OD450值≤1.0的阳性样本数只占到总阳性样本数4.30%（数据结果中未列出），因此用琼扩法开展猪流行性腹泻病的免疫抗体评价一定程度上可用于替代ELISA法，这具有重要的现实意义。