间接竞争ELISA检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯

尚淑娜 - 生 威 王璐璐 - 赵秋霞 - 王 硕 o

(1. 食品营养与安全国家重点实验室〔天津科技大学〕，天津 300457；2. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

邻苯二甲酸酯(PAEs)类塑化剂主要添加在塑料中，用来提高其柔软度及延展性[1-2]，产量大、种类多，广泛存在于食品容器、玩具、乙烯基涂料、油漆和香水中[3]。邻苯二甲酸酯类塑化剂与塑料基质不以化学键结合，随着时间、温度和pH值等的影响，它会从塑料制品中不断迁移到环境或食品中，进而进入人体[4]。

邻苯二甲酸酯类塑化剂稳定性高，具有生物富集作用和雌激素效应，会干扰机体内正常的激素水平，可能会引起生殖系统异常致畸、致癌等。此外，邻苯二甲酸酯类塑化剂不易降解，会对环境造成污染，已成为全球普遍的污染物之一[5-7]。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是邻苯二甲酸酯类塑化剂中应用最广泛的一种，最容易从塑料包装膜中向被包装食品迁移，具有肝脏毒性和生殖毒性，会引发动物肝脏病变和精子畸变率增高[8-9]。中国2016年发布的GB 9685—2016《食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准》，要求邻苯二甲酸二丁酯生产的材料或制品不得用于接触脂肪性、乙醇含量高于20%的食品以及婴幼儿食品，最大残留量和特定迁移限量为0.3 mg/kg。GB 6675.1—2014中规定儿童玩具和儿童护理产品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)和邻苯二甲酸(2-乙基)己酯(DEHP)物质含量的总和不得超过0.1%。

对于邻苯二甲酸酯的检测，目前主要采用气相色谱法[10-12]、气相色谱—质谱法[13-14]、液相色谱法[15-16]、液相色谱—质谱法[17]等。这些仪器检测方法前处理过程较为繁琐，且仪器昂贵、耗时长、操作过程复杂，不适于样品的现场分析和大量样品的检测。相比较仪器方法而言，免疫分析方法具有灵敏度高、特异性好、成本低和易操作等特点。本研究拟以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为研究对象，以4-氨基邻苯二甲酸为原料，通过酯化反应合成半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)，利用重氮化法合成免疫原，得到抗邻苯二甲酸二丁酯的抗体，进而建立间接竞争ELISA方法，用于检测食品中的邻苯二甲酸二丁酯。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

4-氨基邻苯二甲酸：纯度95%，萨恩化学技术(上海)有限公司；

正丁醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、脱脂乳粉、乙酸乙酯、石油醚、甲醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂：美国Sigma公司；

雄性新西兰大白兔：3月龄，体重1.5 kg，北京兴隆实验动物养殖场。

1.1.2 主要仪器设备

超纯水系统：Milli-Q Integral型，美国MILLIPORE公司；

洗板机：MTS 2/4 digital型，美国BIO-RAD公司；

酶标仪：F200 PRO型，美国Thermo公司；

蛋白纯化仪：731-8300型，美国BIO-RAD公司；

分析天平：BL610型，赛多利斯仪器(北京)系统有限公司；

紫外分光光度计：Evolution 300型，美国Varian公司；

气质联用仪：4000MS型，美国Varian公司。

1.2 试验方法

1.2.1 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)的合成与鉴定

(1) 将4.5 g 4-氨基邻苯二甲酸加入到15 mL正丁醇中，超声20 min，在搅拌条件下缓慢加入浓硫酸至液体呈透明，120 ℃回流反应6～7 h。

(2) 减压蒸馏除去未反应的正丁醇和水2～3 h，反应完成后趁热倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取水层，并用10%的Na2CO3调节pH至碱性，用分液漏斗分离，重复萃取，合并萃取液，旋蒸去除乙酸乙酯，得浅黄色固体。

(3) 将得到的浅黄色固体用硅胶板进行纯化。展开剂为体积比1∶3的乙酸乙酯—石油醚混合液，将所需要的条带刮下后加入乙酸乙酯浸泡、涡旋振荡，离心后，取有机相过0.22 μm有机膜，重复几遍后，合并所得到的有机相，旋蒸，最终得到淡黄色的固体，然后进行质谱鉴定。

1.2.2 人工抗原的合成与鉴定 取1.17 mg 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)溶解于100 μL的DMF，加入到1 mL 0.1 mol/L预冷盐酸中，置冰浴中搅拌；逐滴加入1 mol/L 的NaNO2溶液(5～10 μL)至淀粉碘化钾试纸变成深紫色，继续避光搅拌30 min，加入尿素，使试纸不再显色；将20 mg KLH用2 mL碳酸钠缓冲液(pH=9.5)溶解，缓慢加入到上述重氮盐中，加入1 mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液pH值维持在9.0～9.5，溶液逐渐变为橙红色。在4 ℃下避光搅拌反应3 h，PBS透析3 d，得到免疫抗原(DBAP-KLH)。同样按上述方法制得包被抗原(DBAP-BSA)。

用紫外分光光度法观察DBAP-KLH/BSA，DBAP和载体蛋白 KLH/BSA的特征吸收峰的变化情况，鉴定人工抗原是否成功偶联。

1.2.3 抗体制备与纯化 选取体重约1.5 kg的新西兰大白兔(3个月)，采用皮下多点注射方式制备抗体。将等量的免疫原和弗氏完全佐剂乳化后进行初次免疫，在之后的加强免疫中使用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂。每次免疫后7～8 d，耳静脉采血进行抗血清效价及特异性测定，在最后一次免疫后的8～10 d取全血，8 000 r/min 离心后分装冻存在-20 ℃冰箱，使用Protein A-Sepharose 4B柱对兔抗血清进行纯化，制得多克隆抗体。

1.2.4 间接竞争ELISA方法检测步骤 将DBAP-BSA包被抗原用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至一定浓度后，96孔酶标板每只孔中加入100 μL，4 ℃过夜(12～14 h)或37 ℃放置3 h，洗板3次，在滤纸上拍干；每孔加入200 μL 封闭液，37 ℃放置1 h，洗板3次，拍干；加入50 μL DBP标准溶液或者待测样品和50 μL一定稀释倍数的抗体，37 ℃孵育1 h，洗板4次，拍干；加入100 μL/孔酶标二抗(HRP-羊抗兔IgG)，37 ℃ 孵育30 min，洗板5次，拍干；每孔加入100 μL的底物显色液，37 ℃孵育10～20 min，加入终止液50 μL。用酶标仪测定其在450 nm 下的吸光度值。

1.2.5 间接竞争ELISA方法条件优化

(1) 包被量及抗体稀释倍数的优化：选取0.01，0.05，0.10，0.50 μg/孔的包被量和不同的抗体稀释倍数组合进行间接竞争ELISA方法的建立，计算不同包被量下的抗体稀释倍数分别对应的IC50值。选取OD450值在1左右并且IC50值最小的组合作为最优的条件，进行后续试验。

(2) 封闭液的优化：选取0.50%脱脂乳粉、1.00%脱脂乳粉、0.50% OVA和1.00% OVA作为封闭液进行间接竞争ELISA方法的建立，分别计算IC50值，确定OD450在1左右且IC50值最小的作为最适封闭液。

(3) 邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体间接竞争ELISA标准曲线的建立：在最佳条件下，将邻苯二甲酸二丁酯标准品从5 000 μg/L开始，以3倍梯度稀释10个浓度梯度，进行间接竞争ELISA测定，以邻苯二甲酸二丁酯标准溶液浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，用Origin 9.1绘制标准曲线进行拟合，并计算IC50和IC15的值。

1.2.6 特异性测定 选取邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二异丁酯等18种邻苯二甲酸二丁酯的结构类似物进行交叉反应的测定，以评估邻苯二甲酸二丁酯抗体的特异性，交叉反应率(CR)越小，则说明抗体对该目标物的特异性越高，CR按式(1)计算：

(1)

式中：

CR——交叉反应率，%；

IC50(DBP)——抑制率为50%时所对应的DBP的浓度，μg/L；

IC50(结构类似物)——抑制率为50%时所对应的DBP结构类似物的浓度，μg/L。

1.2.7 样品处理

(1) 白酒：取2 mL白酒样品，用PBS稀释3倍后用于检测。

(2) 牛奶：取2 mL牛奶样品，加入3%的三氯乙酸，沉降牛奶中的蛋白质，6 000 r/min离心10 min，取上清液，加入1 mol/L的NaOH调节pH值至中性，用PBS稀释2倍后用于检测。

(3) 食用油：称取1.0 g食用油样品，加入5 mL乙腈，涡旋1 min，4 000 r/min离心2 min，收集上清液，重复提取1遍，将2次收集的上清液混合，旋蒸至干，加入2 mL 甲醇混合后在-20 ℃下冷冻2 h，4 000 r/min离心2 min，取上清液浓缩至近干，加入2 mL含5%甲醇的PBS样本稀释液复溶[18]。

1.2.8 添加回收率的测定 在选取的样品中分别添加0，10，20，50，100 μg/L浓度的DBP标准溶液，每个浓度做3个平行，按1.2.7中方法进行样品的处理，进行间接竞争ELISA的测定，计算回收率。

1.2.9 气相色谱—质谱法仪器方法验证 参考GB 5009.271—2016，选用GC-MS(气相色谱—质谱法)对本试验建立的方法进行验证，确定方法的准确性。

2 结果与分析

2.1 4-氨基邻苯二甲酸二丁酯的合成与鉴定

合成的半抗原DBAP的分子量为293，由图1可以看出其负离子(MS-1)为292.23，与其分子量相符，可以证明半抗原DBAP合成成功。

图1 半抗原DBAP的表征质谱图

2.2 人工抗原的紫外鉴定

用紫外分光光度计对半抗原、载体蛋白和偶联物进行测定，结果如图2所示。由图2可以看出：KLH与BSA蛋白在紫外下的吸收波长为280 nm，半抗原DBAP在285 nm左右有特征吸收峰，半抗原与蛋白质偶联物DBAP-BSA和DBAP-KLH的特征吸收峰与KLH和BSA蛋白相比发生了明显的改变，说明人工免疫抗原与包被抗原制备成功。

图2 DBP、KLH/BSA、DBAP-KLH/BSA紫外可见光谱

2.3 间接竞争ELISA方法条件优化

2.3.1 包被量及抗体稀释倍数的优化 由表1可以看出：包被量一定时，随着抗体稀释倍数增加，OD450值降低，IC50值呈下降趋势；比较不同包被量的IC50值和OD450值，当包被量为0.05 μg/孔，抗体稀释倍数为5 000时，IC50值较低，且其OD450值在1左右。因此选择包被量为0.05 μg/孔，抗体稀释倍数为5 000作为最优条件进行试验。

表1 包被量及抗体稀释倍数的优化

2.3.2 封闭液的优化 由图3可知：封闭液的种类会对OD450和IC50值产生影响。当选用0.50%的脱脂乳粉作为封闭液时，所得到的IC50值最低，并且OD450值在1左右，故选用0.50%的脱脂乳粉作为封闭液进行试验。

图3 封闭液的优化

2.3.3 邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体间接竞争ELISA标准曲线的建立 根据优化的条件，选用0.05 μg/孔的包被量，5 000倍的抗体稀释倍数，0.50%的脱脂乳粉作为封闭液，2万倍的二抗稀释倍数，DBP标准品从5 000 μg/L 开始进行3倍梯度稀释，显色15 min左右，建立间接竞争ELISA方法，得出目标物DBP的标准曲线如图4所示。由图4可知：方法的灵敏度(IC50)和检测限(IC15)分别是(40.68±0.35) μg/L和(1.98±0.15) μg/L。

2.4 特异性测定

用间接竞争ELISA方法对邻苯二甲酸二丁酯的结构类似物进行特异性检测，结果如表2所示。

图4 DBP间接竞争ELISA标准曲线

测试集编号主成分回归R2RMSE偏最小二乘回归R2RMSE10.888 20.149 60.911 10.139 720.893 10.145 50.906 10.141 330.896 10.148 80.901 40.141 7

由表2可以看出：所制备的抗体与DPRP、DIBP和BBP有较低的交叉反应，交叉率都低于10%。可能是因为它们的结构较为相似，与其他结构类似物都无交叉反应。因此，邻苯二甲酸二丁酯的结构类似物对本方法的建立无影响，所获得的邻苯二甲酸二丁酯抗体特异性较好。

2.5 样品的测定

在白酒、牛奶、食用油样品中，分别添加0，10，20，50，100 μg/L浓度的邻苯二甲酸二丁酯标准溶液，每个浓度做3个平行，处理后进行间接竞争ELISA的测定，结果如表3所示。由表3可以得知：添加回收率在84.57%～102.40%。同时，采用气相色谱—质谱法(GC-MS)对间接竞争ELISA方法进行验证，线性方程为：y=31 355x+184 546，R2=0.999 8，添加回收率在85.14%～96.83%。将两种方法进行相关性分析，结果见图5。由图5可知：两种方法具有良好的相关性(R2=0.990 8)，证明本试验所建立的间接竞争ELISA方法较为准确，可以对白酒、牛奶、食用油中的邻苯二甲酸二丁酯进行检测。

表3 ELISA和GC-MS添加回收结果

Table 3 The recovery results of ELISA and GC-MS (n=3)

图5 ELISA和GC-MS检测结果相关性

3 结论

本试验直接将4-氨基邻苯二甲酸作为合成原料，通过酯化反应合成半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯，与之前文献[19-20]报道的合成步骤相比，无需经过4-硝基邻苯二甲酸二丁酯的硝基还原，整个合成过程更简单。试验建立的间接竞争ELISA方法的IC50值为40.68 μg/L，最低检测限IC15为1.98 μg/L，对邻苯二甲酸二丁酯具有较好的特异性。样品中邻苯二甲酸二丁酯的检测结果与GC-MS测定结果有较好的一致性(R2=0.990 8)，证明该方法具有很好的准确性，可以用于食品中邻苯二甲酸二丁酯的检测。本研究方法的灵敏度还不够高，今后可以借助新型荧光标记材料建立新方法提高检测灵敏度。