树莓叶总黄酮的超声波提取及纯化前后抗氧化性研究

余妍 刘咏煌 张青峰

摘 要 目的：探讨树莓叶黄酮类物质纯化前后的抗氧化性比较。方法：采用超声波最佳提取条件提取黄酮后，粗提液中黄酮物质与经AB-8大孔树脂纯化后的提取液中黄酮物质对DPPH自由基的清除率进行比较。结果：超声波提取后的红树莓粗提液中黄酮得率是5.227%，纯化后的提取液中黄酮得率是11.419%。黑树莓粗提液中黄酮得率为8.228%，纯化后提取液黄酮得率提高到16.640%。树莓叶黄酮纯化前后抗氧化性存在较大差异，纯化后抗氧化性增强。当提取液浓度均为0.02 mg·mL-1时，红树莓纯化物对DPPH自由基的清除率增加23.36%，黑树莓纯化物对DPPH自由基清除率增加29.89%。结论：纯化后的黄酮提取液随着黄酮含量的增加抗氧化性增强。

关键词 树莓叶;总黄酮;抗氧化性;DPPH自由基

中图分类号：TS255.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.068

树莓属于蔷薇科植物，又名木莓、托盘、马林等，是多年生小灌木。在果树分类学上属浆果类树莓属（Rubus）果树。根据果实成熟时的颜色，栽培上将树莓分成黑树莓、红树莓、黄树莓、蓝树莓等。树莓的果实、茎、根皆可入药，具有很高的药用价值，被称之为“生命之果”[1]。树莓黄酮是树莓代谢工程中产生的一种重要的有机物，能够预防心脑血管疾病，而且可以抑制癌细胞和提高记忆力[2]。

树莓叶中最常用的黄酮提取方法是有机溶剂提取[3]，近年来超声波提取技术越来越成熟，超声波法原理主要是利用超声波产生的强烈震动、高加速度、强烈空化效应及搅拌作用等，加速植物有效成分进入溶剂，从而有效提高黄酮化合物的获得率，缩短提取时间，并且可免去高温对活性成分的影响[4]。自由基性质活泼，有很强的氧化能力，对人体易造成很大的伤害，与人体的许多疾病有着密切的联系，黄酮类化合物具有很好的清除自由基能力。本研究以黑树莓叶与红树莓叶为原料，采用超声提取法最佳提取工艺，提取黄酮类化合物，以AB-8大孔树脂作为吸附剂进行纯化。通过纯化前后DPPH自由基的清除率反映其抗氧化能力的大小，为今后黄酮类物质在实践中的应用提供基础性的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

红树莓叶和黑树莓叶购自南京金瑞蓝莓专业合作社，洗净沥干后，50 ℃条件下烘干，粉碎成粗粉备用。芦丁标准品（上海源叶生物有限公司）;石油醚（天津市大茂化学试剂厂）;DPPH自由基（上海源叶生物有限公司）;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、镁粉、氢氧化钠等其他试剂均为分析纯。另外，还有MODEL722可见分光光度计（上海现科分光仪器有限公司）、电热恒温干燥箱和R20GB旋轉蒸发仪（上海下丰实业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 树莓叶前处理

将已粉碎的树莓叶5.0 g用石油醚按料液比1∶20的比例用超声波20 min进行脱脂，然后抽滤，将抽滤后的树莓叶放在桌面上自然风干、备用。

1.2.2 样品提取液制备

每次称取干燥药材份1 g于三角瓶中，萃取树莓叶中的黄酮类成分，经超声提取后，抽滤，弃去固体残渣，定容至50 mL，得黄酮粗提取液，备用。将脱脂的树莓叶用体积分数为60%的乙醇溶液按料液比1∶20超声提取60 min，抽滤，收集滤液将其定容至100 mL容量瓶中，备用。

1.2.3 定性检测

1.2.3.1盐酸—镁粉反应

分别准确量取黄酮粗提取液和芦丁溶液5 mL于试管中，加入少许镁粉及盐酸，摇匀，观察反应颜色。

1.2.3.2与三氯化铝的络合反应

分别量取黄酮粗提取液和芦丁溶液5 mL于试管中，加入1%三氯化铝溶液，观察颜色变化。

1.2.3.3与NaOH的反应

分别取树莓叶黄酮提取液与芦丁溶液5 mL，加入1 mL 4%的NaOH溶液，轻轻混匀，观察现象。

1.2.3.4与浓硫酸的反应

分别取树莓叶黄酮提取液与芦丁溶液5 mL，加入1 mL浓硫酸，轻摇混匀，喷滤纸上吹干，观察颜色变化，结果见表1。

1.2.4 定量检测

采用芦丁-分光光度法进行定量检测。

1.2.4.1标准曲线的绘制

准确称取在120 ℃条件下干燥至恒重的芦丁标准品10.0 mg置于50.0 mL容量瓶中，约20.0 mL的无水乙醇溶解，再用30.0%的乙醇稀释至刻度，配制成0.2 mg·mL-1的标准溶液。准确吸取上述芦丁标准液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分别置于10.0 mL容量瓶中，各加入30.0%的乙醇5.0 mL，加入0.3 mL5.0%的NaNO2，摇匀后放置6 min，加入0.3 mL10.0%的Al（NO3）3，摇匀后再放置6 min，加入4.0%的NaOH溶液4.0 mL，分别用30.0%的乙醇定容，摇匀后放置15 min，以试剂空白作为参比，在510 nm处测吸光度A值。以浓度X（mg·mL-1）和吸光度A进行回归分析，得回归方程为A=11.935c+0.0255，R2=0.999 3。

1.2.4.2黄酮含量的测定

1.2.5 黄酮粗提液抗氧化性分析

1.2.6 黄酮纯化及抗氧化的测定

将大孔树脂在乙醇中浸泡、搅拌24 h，然后倒入柱子中，静置24 h，期间确保乙醇的液面高于大孔树脂的液面。一次性完成装柱，静置24 h，上样，静置，静吸附24 h，静置期间避免与空气接触。先用蒸馏水进行洗脱，洗至流出液无醇味为止，然后用体积分数为60%的乙醇溶液进行洗脱，洗至流出液颜色接近无色为止，收集流出液，并将洗脱液旋蒸至尽量少的浓稠液，将纯化后的提取液进行抗氧化测定同2.5。

2 结果与分析

2.1 定性实验

由于黄酮类化合物结构中同时含有碱性氧原子和酚羟基，能与金属类试剂如铅盐、铝盐、铁盐和镁盐等形成有色络合物，由颜色反应的结果可确定树莓叶提取物中含有黄酮。结果见表1。

2.2 纯化前后两种树莓叶的黄酮得率比较

两种树莓叶纯化后的黄酮含量均有提高，黄树莓得率从5.120%提高到11.381%，蓝树莓从9.517%提高到17.872%，结果见图1。

2.3 纯化前后清除率比较

2.3.1 红树莓叶纯化前后对DPPH自由基的清除率

用不同浓度的红树莓叶粗提液及纯化后的样品液对DPPH自由基进行清除，红树莓叶黄酮提取物对DPPH自由基有很强的清除能力，且随着黄酮含量的增加清除率增大。当提取液黄酮浓度同为0.02 mg·mL-1时，粗提物的清除率为59.92%，而纯化物的清除率为83.28%。纯化后的抗氧化能力明显增加，结果见图2。

2.3.2 黑树莓提取液纯化前后对DPPH自由基的清除率

黑树莓叶黄酮提取物对DPPH自由基有很强的清除能力，且随着黄酮含量的增加，清除率增大。当提取液黄酮浓度同为0.02 mg·mL-1时，粗提物的清除率为59.75%，而纯化物的清除率为89.73%。纯化后的抗氧化能力明显增加，结果如图3所示。

3 讨论

本实验根据超声波提取树莓叶黄酮类物质的最优条件进行黄酮提取，总黄酮提取液利用紫外分光光度计为200～600 nm时，发现其最大吸收峰在510 nm處，与芦丁标准品溶液在510 nm处有最大吸收一致，说明实验方法及过程基本正确。树莓叶片中黄酮类化合物提取物对4种自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）均表现出一定的清除能力，且清除能力和黄酮类化合物的含量有关，含量越高，清除能力越强[5]。

通过树莓叶粗提液纯化前与纯化后的得率进行比对可以看出，纯化后的树莓得率明显高于纯化前。树莓叶纯化物清除DPPH自由基的能力很强，且随着黄酮加入量的增加，清除率增大;与粗提物相比，当清除率相同时，纯化物加入量比粗提物加入量明显少，含有相同黄酮量时，纯化提取物清除DPPH自由基能力大于未纯化提取物的清除能力，说明增大黄酮纯度，清除DPPH自由基的能力也增大。由此提示树莓叶黄酮提取后经纯化再利用具有更好的应用前景。

参考文献：

[1] 马晓丽.生物类黄酮的研究进展[J].山西职工医学院学报，2005，15（5）：70-73.

[2] Huntley A L.The Health Benefits of Berry Flavonoids for Menopausal Women： Cardiovascular Disease， Cancer and Cognition[J].Malturitas，2009，63（4）：297-301.

[3] 赵瑞艳，徐雅琴.树莓叶片中黄酮类物质提取及抗氧化性研究[J].中国农学通报，2006，22（2）：104-106.

[4] 黄琼，黎贵卿，陈海燕，林翠梧.超声波法提取牡荆总黄酮的工艺及其抗氧化性的研究[J].安徽农业科学，2009，37（6）：2544-2545.

[5] 杨国慧，张岩，于洋，等.树莓叶果黄酮类化合物含量及抗氧化性分析[J].湖北农业科学，2015，54（18）：4514-4518.

（责任编辑：刘昀）