五种药食同源花提取物体外协同抗氧化作用

余祥雄,梁泽明,肖性龙,余以刚

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510641)

五花茶是一种广东人喜欢的传统凉茶之一,配方通常包含金银花、葛花、代代花、白扁豆花、木棉花、菊花、槐花或鸡蛋花等。随着中医药理论的发展及人们健康意识的提高,“药食同源”越来越受到关注。根据中医药理论,提高体质和预防疾病有时比后期治疗更加重要,因此人们常把药食同源的中药开发成饮料或保健品[1-2]。上述茶中葛花和木棉花不是药食同源材料,不能用作普通食品原料。金银花、菊花、槐花、白扁豆花和代代花均为药食同源中药材,无毒,可作为普通食品原料。来源于植物原料的天然抗氧化成分主要有黄酮、类胡萝卜素和维生素,通常表现出广泛的生物效应,如抗菌、抗病毒、抗衰老和抗癌[3]。金银花含有绿原酸和木犀草素等药理活性成分,具有抗菌消炎和清热解毒等功效[4-5];菊花具有平肝明目、散风清热、消咳止痛和抗黑色素生成的功效[6-7];槐花具有清热凉血和抗菌消炎等功效,被用于治疗与出血有关的疾病,如便血、痔漏和痢疾等[8-9],且槐米是一种提取芦丁的重要原材料;代代花具有理气宽胸、开胃止呕、抗凝血、抑菌和抗肿瘤等功效[10-11];白扁豆花能够改善人体的脾虚湿盛的情况[12]。这五种药食同源花组合成的凉茶对清除体内自由基具有较好的作用[13]。

目前,主要有三种评价抗氧化作用协同效应的方法[14]。一是加和法,即先将单一抗氧化剂抗氧化能力值按贡献率进行加和,然后将所得理论抗氧化能力值与复配物实测抗氧化能力值相比较,从而判断是否有协同效应[15];二是直接比较法,在相同浓度条件下,比较单一抗氧化剂抗氧化能力与复配物抗氧化能力的大小,从而判断是否有协同效应[16];三是响应曲面法,该方法从数学水平上分析抗氧化作用的协同效果,能够通过量化的方式清晰的看到多种因素之间的关系[17]。

本研究通过DPPH自由基清除试验和AAPH诱导红细胞溶血试验分别评价样品的抗氧化效果,采用直接比较法与加和法判断五种药食同源花提取物之间的协同作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菊花、金银花、槐花、代代花、白扁豆花 广州志宁药业有限公司;抗凝羊血 鸿泉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、福林酚试剂、没食子酸、芦丁 Sigma公司;抗坏血酸 上海源聚生物科技有限公司;2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2-azobis-(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH) 阿拉丁试剂上海有限公司;其他试剂 均为分析纯。

T1000型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂;MK3酶标仪 广东环凯微生物科技有限公司;UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;HH-2数显恒温水浴锅 常州奥华仪器有限公司;JW-3021HR高速冷冻离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 分别称取一定量干燥的金银花、菊花、槐花、白扁豆花、代代花,以料液比1∶100 (g/mL),在90 ℃水浴的条件下提取100 min。提取完毕后减压抽滤得到滤液。滤液在55 ℃条件下进行减压蒸馏,浓缩液经真空冷冻干燥得到提取物粉末。根据实验室前期感官评价试验所得复配物的优化配方[18],将提取物粉末进行复配:菊花50%、槐花18%、白扁豆花15%、代代花12%、金银花5%。多酚、黄酮含量检测时,白扁豆花、代代花提取所得滤液直接用于检测,金银花、菊花、槐花提取所得滤液稀释10倍后进行检测。

1.2.2 多酚含量检测 参考Singleton等[19]的方法稍作改进,采用Folin-Ciocalteu法测定1.2.1中所得滤液的多酚含量。取15 mL具塞比色管,依次加入0.5 mL样品溶液、0.5 mL Folin-Ciocalteau试剂、2 mL ddH2O,混匀,反应6 min,加入5.0 mL Na2CO3溶液(70 g/L)和4 mL ddH2O,室温暗处放置90 min后于760 nm波长处检测吸光度。标准曲线以没食子酸为标准物(25、50、75、100、125、150、175 μg/mL)。重复3次,结果以没食子酸当量(Gallic acid equivalents)表示,单位为μg GAE/mL。试验步骤中以蒸馏水替代Folin-Ciocalteau试剂,作为对应的空白背景试验。以多酚含量为横坐标,吸光值为纵坐标,所得标准曲线方程为y=0.0036x+0.054(R2=0.9991)。

1.2.3 黄酮含量检测 参考Enayat等[20]的方法并加以改进,检测1.2.1中所得滤液的黄酮含量。在15 mL具塞比色管中加入1 mL样液、4 mL ddH2O、0.3 mL NaNO2溶液(0.05 g/mL),混匀,25 ℃放置5 min。加入0.3 mL AlCl3溶液(0.1 g/mL)。6 min后,加入2 mL NaOH溶液(1 mol/L)和2.4 mL ddH2O。于490 nm波长处检测吸光度。标准曲线以芦丁为标准物(200、300、400、500、600、700 μg/mL)。重复3次,结果以芦丁当量(Rutin equivalent)表示,单位为μg RE/mL。试验步骤中以蒸馏水代替NaOH溶液加入,作为相应的空白背景试验。以黄酮含量为横坐标,吸光值为纵坐标,标准曲线方程为y=0.0017x-0.1375(R2=0.9988)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的测定 参考Jiang等[21]的方法并加以改进。分别取1 mL样品溶液,加入5 mL DPPH乙醇溶液(0.005% W/V),立即混匀,30 min后用蒸馏水作参比在517 nm波长处测定其吸光度。

按公式(1)计算各样品的DPPH自由基清除率。

式(1)

式中:A对照:1 mL ddH2O加5 mL DPPH乙醇溶液吸光度;A样:1 mL样品稀释液加5 mL DPPH乙醇溶液吸光度;A空白为1 mL样品稀释液加5 mL乙醇吸光度。

1.2.5 抑制AAPH诱导的红细胞溶血作用测定 羊血红细胞悬浮液的制备参考Wang等[22]的方法进行,将含有肝素钠抗凝剂的羊全血在2000 r/min、4 ℃下离心10 min,去除上层的血清,得到红细胞沉淀。用PBS(pH7.4)至少冲洗三次,直至上清液澄清为止,以充分去除残留的血清。取红细胞沉淀适量,用PBS(pH7.4)配成20%的红细胞悬浮液,4 ℃冰箱保存。

参考张虹等[23]的方法进行AAPH诱导羊血红细胞氧化溶血试验。首先,将200 μL细胞悬浮液与200 μL样品或PBS缓冲液混匀,然后在37 ℃下轻微震荡孵育30 min。孵育结束后,加入400 μL AAPH(200 mmol/L)或PBS缓冲液。混合液在37 ℃下,继续震荡孵育2 h。结束后,加入5 mL PBS,在2000 r/min、4 ℃下离心10 min,在540 nm处测定上清液吸光值,吸光值为A。将5.6 mL超纯水加入到200 μL细胞悬浮液中,达到完全溶血,其吸光值为B。正常组用PBS代替AAPH和样品;损伤组用PBS代替样品;毒性试验组用PBS代替AAPH。

样品的溶血抑制率通过公式(2)计算:

式(2)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 多酚、黄酮含量检测结果

五种药食同源花中的多酚和黄酮含量检测结果见表1。

表1 五种药食同源花中的多酚和黄酮含量Table 1 Contents of polyphenols and flavones in five kinds of medicine food homology flowers

由表1可知,五种药食同源花原料的总多酚含量由高到低为:槐花>金银花>菊花>代代花>白扁豆花。总黄酮含量由高到低为:槐花>金银花>菊花>白扁豆花>代代花。槐花、菊花和金银花总黄酮含量均大于总多酚含量,而白扁豆花和代代花总黄酮含量均小于总多酚含量。这一结果与严和平等[24]所得结果一致,有些花卉黄酮含量高于多酚含量,而有些花卉黄酮含量则低于多酚含量。而且,张建勇等[25]也测得菊花中的黄酮含量大于多酚含量。

2.2 五种药食同源花提取物及复配物的DPPH自由基清除能力

分别检测五种药食同源花提取物及复配物的DPPH自由基清除能力,结果见图1。

由图1可知,五种药食同源花的提取物及复配物对DPPH自由基的清除率与浓度成量效关系,在一定浓度范围内，浓度越大对DPPH自由基的清除率越大。当浓度在50～150 μg/mL范围时,复配物和槐花提取物清除DPPH自由基的效果与浓度程线性关系,回归方程分别为y=0.5911x-7.8289,R2=0.9927和y=0.5688x-6.0989,R2=0.9975。复配物和槐花提取物的DPPH自由基清除率在浓度为150 μg/mL时分别为79.36%±0.87%和78.41%±0.68%,在浓度为500 μg/mL时达到最大,分别为89.20%±0.44%和86.82%±1.25%;当浓度在50～200 μg/mL范围时,菊花和金银花提取物清除DPPH自由基的效果与浓度程线性关系,回归方程分别为y=0.3825x-3.8516(R2=0.9964)和y=0.3487x-1.0326(R2=0.9944)。菊花和金银花提取物均在500 μg/mL时DPPH自由基清除率达到最高,分别为87.59%±0.59%、91.13%±1.84%;当浓度在50～900 μg/mL范围时代代花和白扁豆花提取物对DPPH自由基的清除率呈现较好的线性关系,回归方程分别为y=0.0761x-1.5718,R2=0.9976和y=0.0745x-2.2628,R2=0.9982,但是在较低浓度时对DPPH自由基清除效果较差。

根据线性回归方程可计算出各提取物的IC50值,大小顺序为复配物(97.83 μg/mL)<槐花(98.63 μg/mL)<菊花(140.79 μg/mL)<金银花(146.35 μg/mL)<代代花(692.24 μg/mL)<白扁豆花(701.51 μg/mL)。IC50值越小则其抗氧化能力越强,从而可判断各提取物对DPPH自由基清除能力的强弱。复配物的DPPH自由基清除能力最大,相对于其他提取物,复配物减少了单一品加入的量,而DPPH自由基清除能力明显增加,表明五种提取物之间存在明显的协同作用。

按照优化后的配方,当复配物浓度为300 μg/mL时,此时溶液中菊花、槐花、白扁豆花、代代花和金银花提取物浓度分别为150、54、45、36和15 μg/mL。菊花和槐花提取物浓度在线性范围内,可根据回归方程分别算出清除DPPH自由基的贡献率。由图1及上述分析可知,在较低的一定范围浓度下,白扁豆花、代代花和金银花清除DPPH自由基能力与浓度有较好的线性关系,由此可根据回归方程分别算出清除DPPH自由基的贡献率。加和五种药食同源花提取物清除DPPH自由基的贡献率为84.54%。由图1可知,复配物浓度为150 μg/mL时,DPPH自由基清除率已达到79.36%±0.87%,大于此浓度时，已超过线性范围,复配物浓度为300 μg/mL时,DPPH自由基清除率实测值为87.54%±0.85%,这说明五种药食同源花之间产生了明显的协同效果。

图1 五种药食同源花提取物及复配物的DPPH自由基清除能力

药食同源材料中多酚或黄酮含量与其抗氧化能力有较大关系,一般来讲多酚或黄酮含量越高,原料的抗氧化能力越强。菊花提取物中的多酚和黄酮含量均比金银花提取物低,但其抗氧化性略高于金银花,从而说明试验所用的粗提物中,除了主要物质多酚、黄酮在起作用外,还可能有其他一些成分在起作用,如萜类、皂苷和多糖等。

2.3 五种药食同源花提取物及其复配物对AAPH诱导红细胞溶血的抑制作用

红细胞氧化模型是通过添加抗氧化剂来抑制自由基诱发红细胞损伤,测定反应终体系中溶血抑制率来评价保护剂细胞内抗氧化活性的一种方法。AAPH是一种水溶性的偶氮类(R-N=N-R)自由基引发剂,在37 ℃、酸碱中性条件下会分解,产生的自由基可以诱导膜组织上的脂质和蛋白质产生过氧化反应,导致细胞膜破坏、红细胞溶血[26]。红细胞结构简单、氧化应激反应灵敏,是评价抗氧化活性比较理想的模型[27]。五种药食同源花提取物及其复配物对AAPH诱导红细胞溶血的抑制作用检测结果见图2。

图2 五种药食同源花提取物及其复配物对AAPH诱导红细胞溶血的抑制作用

根据图2,通过差异显著性分析,五种药食同源花提取物自身对红细胞溶血有一定的影响,但不显著(p>0.05),说明五种药食同源花的提取物及复配物对羊血红细胞没有毒性作用。当剂量在50～500 μg/mL之间时,槐花提取物和复配物表现出很强的溶血抑制作用,而白扁豆花、金银花、菊花和代代花在浓度为50～500 μg/mL之间未表现出很强的溶血抑制效果,在500 μg/mL时溶血抑制率分别为52.73%±1.76%、43.98%±3.17%、49.55%±4.95%和42.63%±0.17%。除金银花外,其他几种提取物随着剂量增加,抑制溶血效果均有不同程度的增大。金银花提取物中含有促进溶血的成分和抑制溶血的成分,当促进溶血的成分和抑制溶血的成分浓度达到平衡时,出现提取物剂量增加但溶血抑制效果变化不明显的现象。黄娜等[28]研究表明,金银花有一定的溶血风险,有效部位溶血作用的相对强弱为金银花总皂苷>总酚>总环烯醚萜。

槐花提取物和复配物各剂量组对红细胞溶血的抑制作用与损伤组之间存在显著差异(p<0.05),表明槐花提取物和复配物对AAPH诱导的红细胞体外氧化溶血反应均具有抑制作用,且呈现剂量依赖关系,随着剂量的增加,抑制率也会增加。剂量在50～300 μg/mL之间时槐花提取物对红细胞的溶血抑制率小于复配物,当剂量达到300 μg/mL时,槐花提取物和复配物对红细胞的溶血抑制率分别为77.83%±1.85%和80.94%±1.46%。相对于五种药食同源花的提取物,复配物减少了单一品加入的量,而增加了对AAPH诱导红细胞溶血的抑制作用,表现出明显的协同效果。

剂量在50～300 μg/mL之间时，槐花提取物对红细胞的溶血抑制率随着浓度而增大。当剂量大于300 μg/mL时,浓度的变化对红细胞的溶血抑制率的影响不明显,当剂量大于400 μg/mL时,浓度对红细胞的溶血抑制率接近最大值,而且由于在饮料实际生产中槐花提取物和复配物的浓度均小于300 μg/mL,故分析五花茶协同效果时主要考虑剂量在50～300 μg/mL之间对红细胞的溶血抑制率的影响。

3 结论

根据DPPH自由基半数清除率(IC50)实验结果,在DPPH体系中,各提取物抗氧化能力大小顺序为复配物>槐花>菊花>金银花>代代花>白扁豆花。使用单一原料时,槐花对DPPH自由基清除效果最好。当复配物浓度为300 μg/mL时,复配物DPPH自由基清除率以贡献率加和值84.54%作为预测值,小于实际测得值87.54%±0.85%,五种提取物发挥出明显的协同效果。在AAPH诱导红细胞溶血体系中,复配物和槐花提取物表现出很强的溶血抑制作用,而金银花、菊花、代代花以及白扁豆花提取物仅表现出较弱的抑制作用。剂量在50～300 μg/mL时，槐花提取物对红细胞的溶血抑制率小于复配物,当剂量达到300 μg/mL时,复配物对红细胞的溶血抑制率大于槐花提取物,分别为80.94%±1.46%和77.83%±1.85%,复配物同样表现出一定的协同效应。以DPPH自由基清除试验和AAPH诱导红细胞溶血试验对五种药食同源花的水提物及其复配物进行抗氧化能力评价,在两个体系中均能发现五种提取物之间具有协同抗氧化效应。