浙贝母黑斑病病原真菌的药敏性研究＊

温思思 徐云飞 邹真瑶 赵伟春

（浙江中医药大学生命科学学院，浙江杭州 310053）

浙贝母黑斑病是危害浙贝母的真菌性病害，受害植株提早枯死，地下鱗茎瘦小，造成严重减产，多雨年份发病尤其严重。生产上主要以化学防治为主，辅以生物及生态防治。然而目前还未有防治浙贝母黑斑病的登记药剂，生产中盲目用药的现象十分普遍。因此，急需筛选出有效的针对浙贝母黑斑病的高效药剂。通过对磐安县浙贝母种植区的田间调查发现咪鲜胺、苯醚甲环唑、异菌脲是目前常用的3种杀菌剂。本实验采用生长速率法和抑菌圈法对浙贝母黑斑病病原真菌链格孢菌和细极链格孢菌与咪鲜胺、苯醚甲环唑、异菌脲3种杀菌剂的药物敏感性进行研究，为浙贝母黑斑病防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

链格孢菌和细极链格孢菌均由本实验室提供。45%咪鲜胺水乳剂：斯特贝尔作物保护有限公司，批号：HNP37295-C1827；10%苯醚甲环唑水分散粒剂：山东贵合生物科技有限公司，批号：SNA8C00115；500g/L异菌脲悬浮剂：苏州富美实植物保护剂有限公司，批号：HNP32126-D4092。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌悬液制备

将链格孢菌、细极链格孢菌分别接种于PDA培养基中，28℃培养5d。用无菌的PBS洗涤培养基上的菌丝和孢子，收集于50mL离心管中，收集孢子时先用无菌纱布过滤，再用无菌的PBS洗涤离心两次后计数，备用。

1.2.2 药物敏感性检测

（1）生长速率法：用无菌水将3种试验药液配制成7个不同浓度，随后将PDA培养基冷却至60℃，并按照药液：培养基=1:9的配比，配置出新的含药培养基，空白对照组加等量无菌水的培养基。用无菌打孔器（直径为9 mm）从生长状态良好的菌落边缘打下菌饼，将菌饼的菌丝面朝下接种到各含药液及空白对照培养基中，28℃培养3～4d。十字交叉法测量各菌落的直径，每处理重复6次，取平均值（mm），计算菌丝的生长抑制率和EC（SPSS软件计算）。

图1 3种杀菌剂对链格孢菌的抑制作用

图2 3种杀菌剂对细极链格孢菌的抑制作用

生长抑制率（%）=[(1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100

（2）抑菌圈法：吸取孢子悬液100μL，均匀涂布于PDA培养基上，使用无菌打孔器在平板上打直径6mm的孔5个，用无菌针头挑出孔内琼脂。向孔内加入100μL一定浓度的药液（浓度见表1），以无菌水作为空白对照，28℃培养3-4天后观察抑菌圈大小，每处理重复4次，求平均值（mm）。

2 结果

2.1 生长速率法测定不同药剂对菌丝生长的影响

结果见图1-图3。当咪鲜胺浓度在0.012～12μg/mL时，对链格孢菌和细极链格孢菌菌丝的抑制率分别为 4.56%～90.01%和5.00%～85.70%，EC分别为 0.798和0.976μg/mL；当苯甲醚环唑浓度在 0.0002～200μg/mL时，其对两种真菌的抑制率分别为3.45%～81.92%和4.12%～82.82%，EC分别为1.023和0.948μg/mL；当异菌脲浓度在0.00005～50μg/mL时，其对两种真菌的抑制率分别为15.71%～94.83%和16.19%～94.76%，EC分别为0.015和0.014μg/mL。3种药剂对链格孢菌的毒力回归方程的斜率分别为0.9724、0.4602和0.4194，对细极链格孢菌的毒力回归方程的斜率分别为0.9092、0.4679和0.4155。表明异菌脲对链格孢菌的毒力活性最强，链格孢菌对咪鲜胺的敏感性最好，其次为苯醚甲环唑。

2.2 抑菌圈法测定不同药剂对真菌孢子的抑制作用

图3 链格孢菌和细极链格孢菌对3种杀菌剂的敏感性比较

结果见表1。咪鲜胺在3.75～120μg/mL时，对链格孢菌和细极链格孢菌的抑菌圈分别为5.25～21.25和5.00～23.25mm，抑制程度均从不敏到极敏;苯醚甲环唑在2.5～80μg/mL时，对两种真菌的抑菌圈分别为8.00～26.00和8.50～27.25mm，抑制程度均从低敏到极敏；异菌脲在31.25～1000μg/mL时，抑菌圈分别为9.75～24.25和9.75～23.25mm，抑制程度均从低敏到极敏。因此，苯醚甲环唑对链格孢菌和细极链格孢菌的抑制作用最强，其次为咪鲜胺。

3 讨论

从生长速率法和抑菌圈法所测的结果可知，咪鲜胺、苯醚甲环唑、异菌脲等三种药剂对浙贝母黑斑病病原真菌链格孢菌与细极链格孢菌的菌丝生长速率与孢子萌发均有一定的抑制作用。其中两种病原真菌对同一种杀菌剂的敏感性差别不大，田间用药时不必考虑该病的真菌种类。

在生长速率法测定中，EC值大小为衡量药剂毒力大小的重要指标，其值越与药剂的毒力成反比。杀菌剂室内毒力测定中EC值越小、斜率越大，则说明病原菌对药剂的反应灵敏度越高，即随着浓度的增加，抑制率明显增大。本实验中，就不同杀菌剂而言，异菌脲的EC小、斜率大，对菌丝生长速率的抑制率最强。

在抑菌圈法的结果中，咪鲜胺与苯醚甲环唑对孢子萌发的抑制率明显优于异菌脲，此种情况与3种药剂不同的作用机制有关。咪鲜胺通过抑制麦角甾醇的生物合成，从而使菌体细胞膜功能受破坏而起作用，在植物体内有一定的内吸传导作用。苯醚甲环唑具有保护、治疗和内吸活性，是甾醇脱甲基化抑制剂，抑制细胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌的生长。异菌脲能抑制蛋白激酶，控制许多细胞功能的细胞内信号，包括碳水化合物结合进入真菌细胞组分的干扰作用。因此可以尝试将咪鲜胺和苯醚甲环唑用于链格孢属菌引起的浙贝母黑斑病的预防和早期防治，并建 议在生产中可交替使用苯醚甲环唑和咪鲜胺，以便更好地控制病害的发生，减少抗药性的产生；异菌脲则用于黑斑病的中晚期，以便控制菌丝大量生长。同时3种药剂毒力回归方程的斜率都低于1，病原真菌是否已经产生一定的抗药性，田间生产是否可以考虑敏感性更高的药剂用于链格孢属引发的浙贝母黑斑病的防治。由于药剂的剂型不同，考虑的溶解度、滤纸片吸附性、操作便捷等因素，并结合预实验结果，此次抑菌实验摈弃滤纸片法和牛津杯法，而是采用平皿打孔法技术。

表1 不同药剂对链格孢菌和细极链格孢菌的抑制作用

本实验结果仅为室内测定结果，只能说明咪鲜胺、苯醚甲环唑和异菌脲3种药剂在离体条件下对病原真菌的直接作用，并不能准确反映其在田间的防治效果，因此，有待进一步的田间试验，以便在生产上更好的推广和使用。

此外本次实验我们实验室只采用三种黑斑病防治常用药剂，文献表明，腐霉利、三唑酮、啶菌恶唑、嘧菌酯等药剂对黑斑病病原菌也有抑制作用，若想对浙贝母黑斑病进行有效防治，应结合现有数据，对其他药剂综合研究。