商洛枇杷叶科罗索酸含量及纯度测定

张晓文

(商洛学院, 陕西 商洛 726000)

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb)的叶子。又名巴叶、芦桔叶。有清肺止咳，和胃利尿，止渴的功效[1]。研究表明枇杷叶中含多种三萜酸类化合物，以齐墩果酸、科罗索酸、山楂酸为主[2,3]。三萜酸类化合物具有抗炎[4,5]、抗癌[6～8]、降血糖[9]、抗病毒[10]等生物活性，尤其是科罗索酸具有较强的降血糖生物活性[11]。枇杷叶分布于陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、四川、贵州、云南等地，但目前还未见商洛本地枇杷叶中科罗索酸的含量研究。笔者旨在探究商洛本地产枇杷叶中科罗索酸的含量及提取分离方法，为其进一步研究提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

SHB-Ⅲ循环水多用真空泵、RE-52A旋转蒸发器、恒温水浴锅、EKY0016058低速台式大容量离心机、GZX-DH-50电热恒温干燥箱、UV-2600紫外分光光度计、日本岛津LC-2010 A HT液相色谱仪。

1.2 试剂

甲醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯均为分析纯，工业乙醇，薄层层析硅胶G(青岛胜海精细硅胶化工有限公司)、D101大孔吸附树脂(青岛海洋化工厂)、C-18反相硅胶(国药集团化学试剂有限公司)、LH-20葡聚糖凝胶(北京瑞达恒辉科技发展有限公司)、科罗索酸标准品(宝鸡晨光生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 枇杷叶科罗索酸的提取

枇杷叶于5月份采自商洛市，经商洛学院李筱玲药师鉴定为蔷薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb)的叶。洗净烘干后粉碎，称取1 kg枇杷叶粗粉置于提取罐中，加入80%乙醇，料液比为1∶8，100℃回流提取2 h，提取液过滤药液收集，残渣置于提取罐中，加入80%乙醇二次回流提取，料液比1∶6，100℃回流提取2 h，提取液过滤，残渣弃去药液与一次提取药液合并收集，合并后药液减压浓缩至浸膏，冷冻于-20℃冰箱备用。

2.2 大孔吸附树脂初步分离科罗索酸

2.2.1 薄层色谱条件选择 取科罗索酸标准品少许用甲醇溶解，硅胶G铺板，0.5 mm毛细管点板，展开系统选择氯仿-甲醇系统和乙酸乙酯-甲醇系统，按不同比例依次展开，显色剂为重铬酸钾-硫酸，5 g重铬酸钾溶于100 mL，经显色剂显色后最终选择氯仿-甲醇(13∶1)，乙酸乙酯-甲醇(35∶1)。

2.2.2 大孔吸附树脂预处理及分离操作步骤 取部分枇杷叶提取物浸膏60 ℃水浴解冻，解冻后溶解于60%乙醇中，充分溶解后使用离心机离心，离心机转速为5 000 r·min-1时间15 min，沉淀收集放置于4℃冰箱保存备用，上清液用D101-大孔吸附树脂大孔吸附树脂分离。上样完毕后开始使用60%乙醇洗脱，前500 mL液体弃去，然后开始收集液体(每瓶500 mL)。再分别用70%，80%，90%乙醇溶解沉淀上样并用相应浓度乙醇洗脱。洗脱液按顺序编号、点样、薄层展开、喷显色剂显色，将Rf值相同的斑点洗脱液合并。各组分分别用旋转蒸发仪浓缩至小体积，4 ℃保存。

2.2.3 C-18反相硅胶柱纯化科罗索酸粗品 用水-甲醇梯度冲洗，依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，100%甲醇洗脱。将收集到的液体点板，相同的合并。

2.2.4 DEAE-Sephadex LH-20柱进一步纯化 将硅胶柱纯化所得产品溶于70%甲醇(3.5 mL)上DEAE-Sephadex LH-20柱进一步纯化。用70%甲醇洗脱，流速1.0 mL·min-1。按顺序编号点板、薄层展开，Rf值相同的斑点洗脱液合并，收集至瓶皿充氮气使其干燥。

2.2.5 产品紫外全波长扫描 对纯化所得产品进行紫外全波长扫描定性分析，得到其最大吸收波长。取少量纯化产品使用100%甲醇溶解至3 mL，100%甲醇作为空白对照，使用紫外分光光度计进行紫外全波长扫描，波长范围为200～700 nm，扫描速度为120 nm·min-1。

2.2.6 高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography，HPLC)测定纯化后产品中科罗索酸纯度

(1)色谱条件。色谱柱为BDS HYPERSIL C18色谱柱(Φ4.6×250 mm)；柱温25℃；流动相：甲醇-水(体积比：83∶17)；检测波长210 nm；流速1 mL·min-1；进样量20 μL。

(2)样品溶液配制。取纯化所得产品使用100%甲醇(色谱纯)溶解至1 mL，使用0.22 μm有机系微孔滤膜过滤溶液。

3 结果与分析

3.1 大孔吸附树脂分离后科罗索酸粗品产量

对比不同浓度乙醇薄层色谱结果，70%乙醇洗脱分离效果较好杂质较少，将70%乙醇洗脱液减压浓缩干燥得到4.69 g科罗索酸。计算可得科罗索酸含量为0.469%。

3.2 C-18反相硅胶柱纯化粗品后产率

纯化前称取粗品0.2226 g，纯化后所得产品质量为0.0253 g。

3.3 DEAE-Sephadex LH-20柱进一步纯化

DEAE-Sephadex LH-20柱进一步纯化后得到产品质量为0.0027 g。

3.4 纯化产品紫外全波长扫描结果

经紫外全波长扫描结果显示纯化产品最大吸收波长为209 nm，紫外全波长扫描图如图1所示：

图1 纯化产品紫外全波长扫描

3.5 HPLC法测得产品纯度

纯化后产品HPLC图如图2所示：

图中标记1号峰为目标峰即纯化所得科罗索酸，峰面积占峰总面积的49.34%，即科罗索酸纯度为49.34%。

图2 纯化产品HPLC图

4 讨论

依据科罗索酸不溶于水，可溶于热乙醇、甲醇的特点，笔者研究使用乙醇回流提取枇杷叶中科罗索酸的方法[12,13]。采用大孔吸附树脂分离枇杷叶中三萜酸类化合物科罗索酸，薄层色谱结果表明70%乙醇作为洗脱剂时分离效果较好，所得粗品中科罗索酸所占比例较大，杂质比例较小。科罗索酸粗品经C-18反相硅胶和DEAE-Sephadex LH-20柱进一步纯化后，薄层色谱结果显示杂质明显减少。

与吕寒等人研究结果相比，商洛本地产枇杷叶中科罗索酸含量为0.469%，低于安徽滁州、江西武宁、福建福州、广东白云山，但高于浙江千岛湖、塘栖和萧山等地[14]。

该制备方法简单易行，具有推广性，进一步改良条件后可用于制备液相。若需要高纯度的科罗索酸，该方法尚需进一步改良。