瓜菜花粉细胞学观察及活力测定概述

贾聖凤　孙德玺　孙守如　邓云　朱迎春　安国林　李卫华　刘君璞

摘    要： 植物的生长发育从花粉发育开始，对植物花粉细胞学的观察与活力测定是研究雄配子发育的工作基础。花粉的生长发育关系到瓜菜类作物自身的生活发育，花粉的活力为花粉发育、植株受精提供了保障，花粉细胞学观察为更好利用掌握花粉发育过程进而研究花调控的分子机制做准备。但影响花粉整个生长发育阶段的因素有很多，为准确地判断花粉活力以及花粉发育关系到植株育性、花芽分化、结实率、光周期等，进一步影响到分子育种及农业经济效益，因此对花粉进行活力测定与细胞学观察必不可少。笔者对葫芦科植物花粉细胞学以及活力测定方法进行了综述，重点介绍了花粉细胞学以及活力测定的方法，对各种相应的方法在蔬菜中的应用进行了总结，并对观察测定的应用进行了一定程度的展望。所介绍的观察测定方法为更好地选出适合判断西瓜、甜瓜、黄瓜等花粉活力及细胞学观察的方法提供了一定的参考，以便于开展授粉育种工作。

关键词： 瓜菜作物; 花粉细胞学观察; 花粉活力测定

Summary of pollen cytological observation and vigor determination of melon and vegetable crops

JIA Shengfeng1，2， SUN Dexi1， SUN Shouru2， DENG Yun1， ZHU Yingchun1， AN Guolin1， LI Weihua1， LIU Junpu1

（1. Zhengzhou Fruit Research Institute， CAAS， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The growth and development of plants begins with pollen development. The study of pollen is related to the observation of plant pollen cytology and the determination of vitality is the basic work to study the development of male gametes. The growth and development of pollen is related to the life and development of melons and vegetables. The vitality of pollen provides guarantee for pollen development and fertilization of plants. Pollen cytology observation is to better utilize the pollen development process and prepare for studying the molecular mechanism of flower regulation. However， there are many factors affecting the whole growth and development stage of pollen. In order to accurately judge pollen vigor and pollen development， it is related to plant fertility， flower bud differentiation， seed setting rate， photoperiod， etc.， which further affects molecular breeding and agricultural economic benefits， so pollen vitality measurements and cytological observations are essential. We summarize the application of pollen vigor and cytological methods in melons and vegetables， providing a reference for better selection of methods suitable for judging watermelon pollen vigor and cytological observation in order to carry out pollination breeding jobs.

Key words： Melon and vegetable crops; Pollen viability determination; Pollen cytology observation

現所知的植物种类近30万种，开花植物比例较大，占据90%以上，其中我国栽培的蔬菜包括20多个科，其中葫芦科为8大科之一，包括苦瓜、冬瓜、丝瓜、黄瓜、西瓜、南瓜、西葫芦等，在中国蔬菜生产中占有重要到地位[1]。根据中国农业统计资料显示，全国2015年蔬菜总产量比粮食总产量高1.64亿t，占农作物播种面积1/10，创造了占种植业近1/3的产值。在蔬菜作物中瓜菜类作物种植面积也在随之增长，其中西瓜的种植面积就占到73%[2]。瓜菜中花作为整个生活史中重要的器官，承载着信息遗传，但具有一定的遗传保守性，对花发育过程的研究关系到植物的生殖过程，进一步关系到植物的经济效益。从花粉的综合性状、大小、萌发孔样式以及外部纹络来进行比较，存在着巨大的差异性，种间差异要大于品种、类型间差异。花粉的发育伴随着花的外部形态的改变，随着开花时间环境的不同，花粉的发育状态以及活力情况也不相同。对花粉细胞学观察及活力测定一方面能更好地掌握花的发育过程，另一方面为更好利用花的调控机制为育种奠定基础和判断作用。当前，对花粉的细胞学观察及花粉活力的测定虽说在不断地进步，在花粉细胞学观察方法方面，主要包括切片法、压片法、电镜检测等方法，以及对花粉活力测定的直接授粉法、染色法、离体培养法等均在不同的作物中进行应用验证，但对细胞学观察以及花粉活力测定在瓜菜中的运用方法并没有系统性地进行总结对比，在各类瓜菜中根据不同的种类观察方法效果也不尽相同。笔者通过对瓜菜中已经运用的观察测定方法进行了概述，以找到适合西瓜花粉细胞学观察与活力测定的方法并加以运用。

1 有花植物花粉发育及观察

在高等植物中花粉大致可分为二细胞型和三细胞型2类，花粉的发育可分为3个阶段，从小孢子发生期到雄配子体形成期到花粉成熟期，其中小孢子发生期即造孢细胞的分化和减数分裂过程，雄配子体形成期即自由小孢子减数分裂后的发育这一系列的过程是细胞学研究的重点，主要涉及到的具体发育过程大致如下：花药发育初期，未分化的孢原细胞进行平周分裂为外层的周缘细胞和内层的造孢细胞。继而周缘细胞分裂形成药室内壁、中层及绒毡层，与花药表皮共同构成花粉囊壁包围造孢细胞及其衍生细胞。另一方面，在周缘细胞分裂的同时，初生造孢细胞经多次有丝分裂产生花粉母细胞，再经减数分裂形成四分体。在花粉发育过程中，绒毡层逐渐向外分泌胼胝质酶，分解胼胝质，使未成熟的4个小孢子互相分离，慢慢形成小孢子，然后小孢子进行第一次不对称有丝分裂，产生细胞核-营养核和生殖核。小孢子发育到一定阶段，生殖细胞逐渐进入营养的细胞质中，形成成熟花粉粒[3]。在花粉成熟之后伴随着外界环境以及自身的生长发育，花粉的活力也随之变化，对花粉细胞发育以及活力测定的研究可更好地为生产与育种做准备。这些过程相对独立但彼此又紧密联系，并受众多基因的调控。对花粉发育时期的观察结合细胞学、转录组学、代谢学为进一步探究花调控相关机制奠定基础。

随着科研技术的提高，对花粉发育时期的划分也更加详细。对花粉发育时期的划分方法也在不断的完善。针对不同作物，花粉发育时期以及活力情况也不相同。在1921年Belling提出植物染色体压片技术后，压片观察已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术。Sanders等[4]根据拟南芥花药发育过程中发生的主要代谢物将花药发育分14个时期。在对拟南芥的花粉结构观察分析中将花粉发育时期划分为15个时期，并对发育过程中花粉母细胞至成熟花粉粒进行了特别关注[5]。随后在水稻中Jun-Ichi Itoh将花药的发育时期划分为8个时期，主要分为两大类——花药孢子体发育时期、雄配子体发育时期[6]。在烟草中根据代谢途径将配子体发育划分为8个时期，并进行了相关代谢通路验证[7]。近年来，人们对花粉发育基本过程的认识有了很大的提高，其中许多信息来自于对雄性不育突变体的详细研究，主要包括拟南芥[8-9]、油菜[10]、棉花[11]、大白菜[12]等植物。

另一方面，花粉活力的测定方法根据每种作物的不同习性来选择，现有的测定方法主要包括花粉人工培养法、染色法、授粉法[13]。1982年对小麦的花粉采用TTC染色法进行了活力测定以判断花粉败育及生理突变情况[14]。随后在检测甜椒贮藏花粉活力比较中采用荧光镜检新鲜花粉和红四氮唑染色镜检贮藏花粉得到了不同温度下花粉活力的变化情况[15]。胡适宜[16]对测定花粉生活力的经典方法——离体萌发测定的方法及步骤进行了详细的介绍总结。除此之外，1994年在烟草中采用了TTC法、联苯胺-α萘酚染色法、I-KI染色法3种方法对烟草花粉活力进行测定，并与发芽率进行了结合，系统地比较了3种染色法结果的差异性。整体来说I-KI染色法的差异性较大。但在染色方法上明显已经有了进一步的探究[17]。随着生物技术的进步，在Randolph首次发现单倍体后，人们开始对单倍体进行研究，在这个过程中涉及到花药、花粉的培养，确保培养的前提在于花粉具有一定的活性，2001在大田作物玉米中为进行单倍体育种采用Sangduen N等[18]的0.5%稀醋酸洋红染色方法进行判断，以染色为全红的花粉粒判定为活性花粉用于单倍体加倍鉴定以获得纯合二倍体。随后王钦丽等[19]分别比较了胡适宜的TTC测定法、p-苯二胺测定法的优缺点。在模式植物拟南芥的花粉研究应用中除了采用常用的TTC染色法之外，还用到了较为简便的Aexander染色法，其判断花粉活力主要根据染液中的孔雀石绿对细胞壁的着色和酸性品红与花粉原生质着色深浅情况[20]。除了普通的染液染色观察，荧光染色显微观察技术也在不断发展应用，对活力的测定运用最多的是荧光素二醋酸酯（FDA），在洋葱、番茄等已成功多次运用。花粉活力的测定方法经常多种方法相互结合对比使用，以判断出最适宜某种植物的方法。通过概述现已有的花粉活力的测定方法，对测定西瓜花粉活力的方法应用有一定借鉴意义，对西瓜生产、选育等方面有一定的辅助作用。

2 瓜类作物花粉细胞发育及活力测定

在植物花的发育阶段中可分为3个阶段：成花诱导、形成花原基、花器官的形成及其发育。这3个发育阶段按照花发育的分子生物学模型包含ABC模型、ABCDE模型。在最初的ABC模型中3个功能区域控制相关组织的产生，A类基因单独控制萼片发育，A类和B类基因共同调控花瓣发育，B类和C类基因控制雄蕊的发育，C类基因单独控制心皮的发育。之后在矮牵牛、拟南芥中发现了D功能基因控制胚珠发育，而E功能基因并不直接转换花器官，而是一类特殊基因参与。基因控制花器官形成过程中包含细胞的分化，在花芽分化的過程中，分化顺序为花原基、萼片、花瓣、雌蕊原基、雄蕊原基5个时期[21]。在成花诱导的过程中与光照和温度等因素密切相关，在外界环境合适的情况下伴随着减数分裂、有丝分裂而发育。在花粉的形成发育过程中，从孢原细胞分化形成造孢细胞经有丝分裂形成花粉母细胞，经减数分裂形成四分体，四分体分离形成单核花粉，每个单核花粉发育伴随着细胞核的运动，划分为单核早期、单核中期、单核靠边期，细胞核经有丝分裂形成双核（营养细胞核、生殖细胞核）最后发育形成成熟花粉粒。

2.1 瓜类作物花粉的细胞发育过程

在葫芦科作物花粉发育过程中细胞发育与其表观性状紧密相连。其花粉发育途径为：小孢子母细胞-四分体时期-单核早期-单核中期-单核靠边期-双核早期-双核中期-双核晚期-三核期-成熟花粉时期。在花粉由花粉母细胞减数分裂，胼胝质包围4个小孢子形成四分体，在不同时期下小孢子形状也不相同。四分体从胼胝质壁破裂释放出外形不规则的小孢子，之后很快变成圆形或近圆形的单核花粉粒，随着单核花粉粒的发育进行有丝分裂形成1个营养细胞和1个生殖细胞的双核花粉粒，双核花粉粒发育到一定阶段，生殖细胞进入营养细胞质中形成成熟花粉粒。在对花粉发育时期的研究中多采用细胞镜检的方式进行观察研究，同时与植物外部形态进行联系。

在对南瓜花粉细胞学的观察中，与花蕾的大小及发育过程中伴随的生物学变化均有相应的研究，在1969年对南瓜与黄瓜的自交授粉与混合授粉后的花粉发育进行了对比，对F2、F3、F4与亲本在花粉管萌发伸长以及对产量进行了对比，是对花粉后期发育的研究[22]。在对南瓜花形态的研究中采用了石蜡切片的方式对固定的南瓜花进行了切片观察，区分两性花与雌雄花的花器官位置差异[23]。除此之外在对生殖器官的解剖研究中，同样也采用了石蜡切片的方式，在对花芽分化和雄配子体发育过程中染色剂存在差异，在对花粉粒的检测中采用更为方便的电镜扫描来对花粉粒的形态进行相关的研究，并按照不同形态特征划分为10个时期[24]。在探究南瓜花蕾与花粉发育时期关系中采用醋酸洋红染色镜检得到花蕾纵横径之比，以及对花粉发育时期之间进行了联系，为小孢子培养做出了准备，同时不同环境不同品种之间花粉发育存在差异，不能一概而论[25]。随后崔群香对花粉母细胞的减数分裂到雄配子发育的过程进行了石蜡切片和压片法的染色观察，对不同时期染色效果进行了比较，相对于单核和双核期压片染色更容易分辨;并采用荧光染色结合观察，对南瓜减数分裂过程中的核现象进行了清晰观察[26-27]。在黄瓜中袁高峰[28]通过石蜡切片对花芽分化和雌、雄花的发育进行了详细的形态学观察并划分为10个时期，指出黄瓜单性花的分化和发育过程经历了无性期、两性期和单性期。对于研究种子败育的现象具有一定的初探作用，对花粉活力以及发育时期伴随的绒毡层等结构的变化观察中发现均与败育现象有关[29]。除此之外对压片染色观察发育时期时，采用了卡宝染色和醋酸洋红染色的方式对减数分裂过程以及雄配子产生过程进行了时期划分[30]。陈芬芬等[31]在对黄瓜花蕾大小与花粉发育時期的研究中采用了醋酸洋红压片法进行了区分，为黄瓜花粉离体培养提供了参考。在西葫芦中王朝阳等[32]采用醋酸洋红染色制片对西葫芦的花蕾的纵横径长度与小孢子发育之间进行了对比分析，小孢子发育时期与花蕾纵横径间以及花蕾节位间相联系，其中各时期间存在差异，为判断发育时期提出了依据。在甜瓜中采用石蜡切片的方式对花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育做出了相关划分，并对发育过程中绒毡层、花药壁、细胞核的形成进行了连续观察研究[33-34]。在瓜类中更多的也是采用石蜡切片、压片染色观察花粉的细胞学，对于不同品种采用的染色剂选择也不同。

综上，在花粉细胞学观察中的办法主要包括切片法、压片法、电镜检测的方法，在不同试验目的条件下对试验方法和试验中用到的染色剂的选择也不同，根据不同的品种、不同的观察时期进行选择。切片法种类较多，根据目的选择合适的方法与切片厚度，相对于压片染色法，用时较长，步骤繁琐;而电镜检测相对于其他两种价格较高，但效果清晰，可根据试验所需加以选择。在诸多方法中，石蜡切片在多种作物中均有运用，压片染色法更为方便快捷，无论哪种方法都应注意染色剂的选择。

2.2 瓜类作物花粉活力变化

在花粉的细胞发育过程中，花粉的育性也随之变化。对花粉活力的测定有助于评判植物遗传育性、对其生长和环境判断、确定授粉状态时间、筛选适合某种特定环境下适宜的品种、有利于花粉的贮藏等，在农业生产实践上有巨大的价值。但花粉活力的测定方法结果要比真实的情况高，伴随着生物信息技术的发展，花粉活力的测定方法在日益完善并加以运用。

葫芦科中花粉活力测定也用于辅助探究葫芦科植物的相关生长研究。在南瓜中运用了TTC法测定成熟花粉粒的活性以及花粉管的伸长情况，结果表明，在6：00达到最高生活力，且在授粉1 h后花粉萌发，8 h后大量花粉管伸进柱头并达到柱头1/2位置，授粉24 h后大量花粉进入子房，开始受精作用[24]。除此之外对3个南瓜品种及其杂交后代的花粉活力采用5个视野取平均值测定，花粉活力最低为7.9%，最高可高达77.2%，与材料花粉的外观有关系，活力低的材料花粉粒存在凹陷、畸形等不良现象[35]。此外还运用了醋酸洋红染色法对鲜花粉和干燥花粉在不同贮藏温度下的活力的变化进行了测定，温度与花粉活力呈负相关，在25 ℃条件下贮藏5 d花粉活力下降到5.63%，而在0 ℃、-15 ℃条件下贮藏15 d花粉活力仍为50.22%和79.51%;在对干燥处理后的花粉进行贮藏15 d，总体而言，当温度下降时活力下降，在长期低温贮藏下花粉活力明显下降[36]。花粉活力的测定时常被用来测定花粉对不同的外界环境的反应。在黄瓜耐冷性的试验中分别采用了I-KI染色法、TTC染色法、醋酸洋红染色法、离体萌发法进行花粉活力测定，花粉萌发率分别为51.43%、83.76%、100%、88.92%。其中醋酸洋红染色法测定萌发率为100%，但由于花粉萌发不可能达到100%，因此该方法误差较大，I-KI染色法要比实际情况低，因此这两种方法均不适合作为最佳观察方法。TTC染色法和离体萌发法结果相近，但对于TTC染色程度存在着非统一标准，存在误差，而离体萌发法更直观，可确定为最佳观察方法[37]。此外，结合染色法、离体培养法对黄瓜贮藏温度与方法的研究，可在不同的测定方法中根据时间、环境等选择合适方法进行测定以达到试验所需目的[38]。许利彩、盛金、李亚莉等[39-41]利用TTC染色法、FDA染色法、醋酸洋红染色法、和离体培养法对西葫芦的授粉时间、低温及生长调节剂等外界刺激下花粉活力进行测定比较，4种方法中TTC染色法和离体培养法更接近于实际情况，而TTC染色法更为方便快捷、易推广。结合甜瓜生长环境对花粉活力在高温胁迫、不同贮藏温度下的测定得到随着温度的上升花粉活力在逐渐下降，在温度高于40 ℃时对于生殖期的花粉活性明显降低[42]。分别对甜瓜雄性不育株、可育株进行了醋酸洋红染色鉴定，并辅以电镜观察整体情况以明确区分甜瓜植株的可育性[43]。在2006年郭尚等[44]就对可能影响西瓜花粉活力的温度、营养、保存条件采用了培养法进行了比较，发现花粉可在8 ℃的低温条件短期保存，随后陈宗光等[45]采用离体培养，发现在4 ℃低温干燥条件下，花粉活力下降更慢，更有利于短期保存，随后杨红等[46]对不同辐射条件下的花粉进行了离体培养比较，加以补充。

各种方法在瓜类作物中均有应用，同时也对每种瓜内部品种、不同种类的瓜进行了花粉活力的对比测定，探寻最适宜的花粉活力测定方法。在南瓜、黄瓜、丝瓜中采用了醋酸洋红染色法同期的花粉活力进行测定，从而判定黄瓜花粉活力较高，对测定方法方面，对人工授粉法、离体培养法、醋酸洋红染色法进行比较，选定较为简单省力的醋酸洋红染色法进行花粉活力测定[47]。但醋酸洋红染色效果要比实际情况高。在苦瓜、南瓜、黄瓜中也采用了离体培养的方法进行了判断，除此之外还对3者花芽分化时期进行了划分，判断最佳授粉时期[48]。

花粉活力的测定的方法包含TTC染色法、醋酸洋红染色法、I-KI染色法、FDA荧光染色法等。在这四者中，均需借助于显微镜进行观察。前3者为普通染色，对环境没有特定要求，FDA染色法需要在避光处进行染色，其与醋酸洋红染色法在测定结果上与实际情况比较，测定结果较高，但也有一定的参考价值。TTC染色、I-KI是使用较多的染色方法，在其染色时间上而言，染色过程需要时间较长，但使用较多，但以测定者肉眼判断为主，没有固定标准。除此之外，离体培养法以花粉管萌发情况为主，与实际花粉活力更为一致，且其有标准可循，简单易操作推广。每种瓜菜的花粉生长情况不同，因此对方法的选择也因种类的不同而不同。选择适合的花粉测定方法更有助于判断。

3 花粉细胞学观察与活力测定应用

3.1 细胞学观察在蔬菜中的应用

在蔬菜中对于花粉发育时期的研究主要集中于对一些雄性不育材料的探究，另一方面借助于对花粉发育时期的研究来更好的为小孢子（花药）培养提供依据。在蔬菜的雄性不育材料的细胞学观察中，雄性不育材料的产生与绒毡层细胞的发育状态相关，葛娟等[49]通过半薄切片、扫描电镜、压片染色的方法对甘蓝的花粉败育的细胞学进行了研究，明确了败育现象出现在单核期，与绒毡层的发育相关。随后李可琪等[50]也通过半薄切片染色及透射电镜进行了相关研究，发现在减数分裂过程中出现异常导致败育的现象。2017年陶兴林等[51]对花椰菜雄性不育材料进行透射电镜观察花败育现象并进行转录组研究，从基因的层面探讨花粉败育原因。另一方面在白菜中对检测相关蛋白基因对花粉发育阶段的影响，对花粉进行细胞学观察更有利于与农艺性状相联系[52]。除了十字花科作物之外，在蔬菜上的应用也较多，在洋葱的雄性不育保持系中采用石蜡切片对其进行研究，发现其不育性与花粉母细胞时期相关[53]。除此之外对蒜科进行了荧光检测，揭示了小孢子发育期对雄性不育系的影响[54]。在辣椒、茄子、马铃薯[55-57]中采用石蜡切片、卡宝品红压片染色的方式对花粉发育时期进行相关的研究总结，对花粉母细胞的发育、绒毡层变化方面做出一定的对比。

3.2 花粉活力测定在蔬菜中的运用

在蔬菜杂交育种中，往往想通过延长花粉的寿命进而为解决一些科研问题作准备，因此花粉活力的测定必不可少，主要在研究自身生长发育环境以及改变雄性不育等情况后的验证中都有运用。例如在对自身生活发育环境方面的应用，在番茄中采用红四氮唑染色镜检与荧光镜检判断不同贮藏时间的花粉的授粉可行性，另外陈新伟[56]、王梓然等[58]用醋酸洋红染色法、离体培养法对不同环境下的花粉活力进行测定以找到适宜花粉萌发的外界条件。在常用的TTC法的基础上运用过氧化物酶测定方法测定花粉活力为番茄的花药培养条件进行比对，为花药培养做了一定的基础[59]。在辣椒[60]、茄子等茄科中运用琼脂离体培养、TTC法、I-KI法进行了比较，发现其中直接用于测定花粉萌发的琼脂离体培养要比TTC法、I-KI法更适用于辣椒花粉活力测定。运用这些方法对影响其产量结实率的光照条件进行了研究总结，用来选择最佳的光照强度，筛选适宜的种植环境。另外TTC法、离体、原位萌发测定的方法也在十字花科植物中进行运用，在白菜中通过TTC染色法、琼脂培养基、液体培养基法和直观观察法对不同花龄的白菜进行了染色率与萌发率的对比，以确定最佳授粉时间进而提高结实率，这4种方法中相对来说，TTC染色法单纯的说明了花粉的活性并未证明其萌发率，而培养法中直接以萌发率来判定花粉活力较为准确[61]。青花菜中比较了二倍体与四倍体之间的花粉活力采用的是TTC染色法、离体萌发法、原位萌发实验进行比较，在这3种方法中就活力高低、整齐度两方面进行对比，TTC染色法与原位萌发实验结果相同，表明二倍体活性较高，与离体培养结果出现差异，最终在直接授粉之后证明二倍体活性结实率较高[62]。甘蓝[63]上也对不同花龄的花粉活力进行了比较，选择适宜的授粉时间，育种工作及新种质的开发启到了一定的借鉴筛选作用。

4 总结与展望

通过对瓜类作物花粉的细胞学观察以及对花粉活力的测定方法总结，以及部分在蔬菜中的应用，对各种那个方法进行了总结。在不同的试验目的与试验要求下选择合适的观察测定方法已达到最佳的目的。在西瓜中对花粉细胞学研究与活力研究利用的方面相对较少，对花粉细胞学研究为更好利用发育阶段获得完整植株提出選择依据，花粉活力的测定进而辅助选择适宜的生长生活条件，为创造良好的经济效益进而做准备。

有花植物中花作为生长发育过程中遗传受精的生殖器官，对植物的育性及新品种的繁育有着重大联系，对花的全面研究包括从形态、细胞、超微结构到代谢物、基因等方面的的不断完善。花粉作为花的主要物质，对其的细胞学研究以及活力测定能够辅助育种者结合花的形态进行相关育种工作，又能为研究各时期代谢物、基因的不同作以表型鉴定。在对花粉的研究发现中，对不育材料与可育材料的研究结合现有的生物技术，从转录组学、代谢组学、蛋白组学从基因、代谢物等方面改善育性等条件为育种工作而完善。在对花粉细胞学与活力测定针对每种作物的不同方法进行总结改进已达到最佳的观察效果与试验目的。

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