木兰花碱的荧光性质及其在中药分析中的应用研究

曹津津 孙启瑞 李文红 宋冉冉 曹倩玉 王可 魏永巨

摘 要 研究了木兰花碱（Magnoflorine，MAG）的荧光光谱和吸收光谱特征，考察了pH值等环境因素对荧光和吸光的影响，探讨了光谱性质与分子结构的关系。木兰花碱水溶液的三维荧光图谱中呈现3个荧光峰，激发波长λex为230、275和315 nm，发射波长λem均为420 nm。随溶液pH值升高，激发光谱中的荧光峰红移并出现等荧光点，吸收光谱中的吸收峰红移并形成等色点，表明木兰花碱分子中的1个羟基发生了质子电离，用pH值-吸光法测得电离常数pKa=4.77。以L-色氨酸为参比，测得木兰花碱水溶液的荧光量子产率Y=0.19。青风藤等多种中药材的三维荧光图谱中呈现木兰花碱的特征荧光峰，λex/λem=315 nm/420 nm处的荧光峰不受共存组分的影响，且荧光强度稳定，据此建立了中药青风藤中木兰花碱的荧光分析新方法。在0.04～1.25 μg/mL范围内，体系荧光强度IF与木兰花碱浓度c呈线性关系，回归方程为：IF=6146.8c+ 24.4（R=0.999， n=11），检出限0.52 ng/mL。采用本方法测得青风藤对照药材中MAG的含量为0.63%，加标回收率为101.2%～102.7%。LC-MS/MS法测定结果为0.61%，与荧光法基本一致。本方法简便快速，结果可靠，有良好的实际应用价值。

关键词 木兰花碱; 青风藤;  中药;  三维荧光;  荧光分析

1 引 言

木兰花碱（又称木兰碱，Magnoflorine，MAG，图1）属于阿朴菲类生物碱（Aporphine alkaloids）[1]，广泛存在于防己科、马兜铃科等药用植物中[2～4]，具有抗氧化[3，5]、膜保护[6]、降血糖[7]和抗遗忘[8]等药理作用，但目前木兰花碱尚未被收录入中国药典或作为药品标准。关于药用植物和生物样品中木兰花碱的分析方法，主要包括色谱法[9，10]、毛细管电泳法[11，12]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法[13]，迄今尚未见关于木兰花碱荧光性质及荧光分析方法的研究报道。

荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、简便快速、环境友好等优点，在生化分析和化学药物分析中应用广泛。但在中药分析中，由于样品所含成分的复杂性以及中药成分荧光光谱数据的缺乏，荧光分析法的应用尚不广泛[14]。目前，中国药典中收录的中药分析方法主要是色谱等方法，荧光法未被用于中药成分的定量分析。用荧光法测定中药成分的含量，难点在于如何避免共存组分的干扰。文献报道的中药荧光分析方法可大致分为两类：一是常规的荧光分析法，基于被测组分与共存组分在荧光波长和强度上的差异，实现快速分析[15，16]; 二是采用三维荧光法结合化学计量学方法[17，18]，利用三维荧光光谱信息，借助数学统计分离程序，实现复杂样品中荧光性质相近的药效成分的计算分析[19，20]。常规方法简便快速，便于应用; 三维荧光结合化学计量学方法可以解决某些常规方法难以解决的问题，扩展了荧光法的应用范围。中药成分种类繁多、数量庞大，开展中药成分荧光性质的研究是发展中药荧光分析法的关键。

本研究组在研究生物碱类化合物的荧光性质时，发现木兰花碱有强荧光，其三维荧光图谱有很好的特征性。将木兰花碱标准品的三维荧光图谱与本实验室前期得到的数百种中药对照药材的三维荧光图谱进行对比，发现青风藤等多种中药材的三维荧光图谱中呈现木兰花碱的特征荧光峰，由此推测这些中药材中可能含有木兰花碱，因此，可望将木兰花碱的荧光性质用于中药分析。本研究对木兰花碱和青风藤的荧光性质进行了详细考察，建立了青风藤中木兰花碱的荧光分析方法，并利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对本方法进行了验证。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F-7000荧光分光光度计（日本Hitachi公司）; UV-2501PC紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）; LC-TRIPLE QUAD 5500液相色谱-串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）; Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）; 828型pH/ISE測试仪（芬兰Orion公司）; 十万分之一分析天平（日本Shimadzu公司）。

木兰花碱（CAS： 2141-9-5，HPLC级，纯度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）溶液：称取木兰花碱对照品2.08 mg，用水溶解并定容至25 mL，配制成83.2 μg/mL木兰花碱标准溶液，低温保存，备用，使用时适当稀释; 青风藤对照药材（1251-0301，防己科植物青藤 Sinomenium acutum （ Thunb.） Rehd. et Wils.（Qingfengteng）的干燥藤茎，中国食品药品检定研究院）; 甲醇（色谱纯，美国Tedia公司），经检验无荧光; 甲酸（色谱纯，美国Dikma公司）; 缓冲溶液：将含磷酸、乙酸和硼酸的混合溶液（均为0.20 mol/L）与NaOH溶液（1.0 mol/L）以一定比例混合，用于调节pH值; L-色氨酸（L-Tryptophan，天津市光复精细化工研究所）; 实验用水为二次去离子水，经检测无荧光。

2.2 实验方法

2.2.1 pH值对吸光和荧光的影响 在一系列10 mL容量瓶中，分别加入适量木兰花碱溶液，以缓冲溶液控制pH值，以水定容，分别扫描各溶液的吸收光谱或荧光光谱，并精确测量pH值，荧光测定时选择激发和发射狭缝（Slit）为5.0 nm，光电倍增管负高压（PMT）为700 V。

2.2.2 荧光量子产率的测量 在25 mL容量瓶中分别加入适量L-色氨酸溶液和木兰花碱溶液（控制溶液浓度，使激发波长下的吸光度A≤0.05），以水定容。测量吸收光谱和荧光光谱，测量激发波长处的吸光度和积分荧光强度。以L-色氨酸为参比（280 nm处的荧光量子产率0.14），计算待测物质的荧光量子产率[21]。

2.2.3 青风藤样品提取液的制备 经不同比例的甲醇-水提取溶剂的对比实验，确定提取溶剂中甲醇的体积分数为60%。称取青风藤对照药材粉末0.025 g，以提取溶剂溶解并定容至50 mL，超声振荡30 min，静置过夜，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得浓度为500 μg/mL的提取液。

2.2.4 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（50 mm × 4.6 mm， 1.8 μm）;  流动相： 甲醇- 0.01%甲酸（60∶40， V/V）;  流速0.3 mL/min; 柱温40℃;  进样量4 μL。

2.2.5 质谱条件 离子源为电喷雾电离源 （ESI）; 气帘气（CUR）： 275 kPa; 离子化电压5.5 kV; 离子源温度500℃; 喷雾气（GAS1）： 345 kPa; 辅助加热气（GAS2）： 345 kPa; 正离子全扫描方式; 采用多离子反应监测（MRM）模式定量分析。木兰花碱的质谱检测参数见表1，与文献[22]中的参数基本一致。

3 结果与讨论

3.1 木兰花碱水溶液的三维荧光图谱

在酸性条件下，木兰花碱水溶液在发射波长（λem）420 nm处呈现一组荧光峰，激发波长（λex）分别为230、 270和300 nm（图2A）; pH值为近中性时（图2B），λem基本不变，λex和荧光峰形有所变化，图2A中300 nm激发峰红移至315 nm; pH值升高至碱性时（图2C），荧光波长基本不变。上述结果表明，在溶液pH值由酸性到近中性的过程中，木兰花碱的分子结构发生了变化，其分子中的羟基可能发生了质子电离[23]。

木兰花碱三维荧光图谱（图2）有较强的荧光强度和很好的特征性。本实验室曾研究过数百种中药材的三维荧光图谱[24]，因缺乏中药成分荧光性质基础资料，其中大多数难以判断荧光峰的归属。将图2与这些中药材的三维荧光图谱进行对比，发现青风藤、川乌、黄连、威灵仙、关黄柏、酸枣仁、淫羊藿等中药材的三维荧光图谱中呈现木兰花碱的荧光峰。因此，木兰花碱的荧光性质可望用于这些中药材的鉴别与其中木兰花碱的测定。

3.2 木兰花碱荧光的影响因素

测定了木兰花碱在不同pH值条件下的二维荧光光谱（图3A）。在酸性条件下（pH 1.7～5.9），随pH值升高，激发光谱中270 nm处的荧光峰减弱并红移至275 nm，230 和300 nm处的荧光峰升高并分别红移至235和315 nm，在252和297 nm出现等荧光点; 发射光谱中420 nm处的荧光峰波长不变，但强度减弱。在近中性及碱性条件下（pH 6.4～14.0），荧光波长和强度均基本不变。荧光强度与pH值之间的关系如图3B所示。

根据不同pH值下木兰花碱的荧光光谱变化推断，在pH 1.7～14.0之间，木兰花碱发生了羟基质子电离。激发光谱中等荧光点的出现表明，在pH值变化过程中，木兰花碱存在两种荧光型体的转化[23]，一种是在酸性条件下的分子型体，另一种是在近中性和碱性条件下的离子型体，两种型体的荧光激发波长不同，发射波长相同，均为420 nm。木兰花碱分子结构中有2个羟基，但只有1个羟基质子电离。从分子结构看，木兰花碱B环上季铵N原子带正电荷，对相邻A环的π-电子体系有吸引作用，使得C1位上的羟基较易电离出质子。文献[25]计算得到C1位OH键能（88.7 kcal/mol）低于C11位OH键能（90.9 kcal/mol）。因此，推测应该是C1位羟基质子电离。质子电离后产生的氧负离子与A环共轭，增大了A环的电子云密度，导致激发波长（吸收波长）红移。另一方面，氧负离子可能与空间距离较近的D环C11位羟基形成分子内氢键[26]，导致C11位羟基质子难以电离。

甲醇和水是提取及测定中药荧光成分时的常用溶剂。本实验结果表明，在水-甲醇体系中，随着甲醇体积分数增大，木兰花碱的λem逐步蓝移; 在甲醇中λem=375 nm，荧光有所增强。从实验成本和环境保护等方面考虑，应选择在近中性水溶液中测定木兰花碱的荧光。

有序介质常对物质的荧光有敏化作用。结果表明， 0.02 mol/L 十二烷基硫酸钠（SDS）和溴化十六烷基三甲铵（CTAB）对木兰花碱水溶液的荧光基本无影响。因此，可直接利用木兰花碱的内源荧光。

在日内和日间（1，3和5 d）分别测量9份相同浓度的木兰花碱水溶液的荧光强度，相对标准偏差（RSD）分别为0.5%和1.2%，表明木兰花碱的荧光稳定。

综上，木兰花碱在近中性水溶液中有稳定的强荧光，适宜用于分析测定。

3.3 木兰花碱的吸收光谱与电离常数

为了验证上述木兰花碱荧光光谱随pH值变化的分子机理，测定了木兰花碱水溶液在不同pH值下的吸收光谱（理论上，荧光激发光谱与吸收光谱的图形相似，随pH值变化的趋势相同），結果见图4A。在酸性条件下，木兰花碱在250～380 nm波长范围内有2个吸收峰，吸收波长分别为268和300 nm。随pH值升高，268 nm处的吸收峰红移至275 nm，吸光度降低; 同时，300 nm吸收峰红移至316 nm，吸光度升高，在254 nm和302 nm形成等色点; pH>6后，吸收光谱不再随pH值的升高而变化。各光谱曲线在320 nm处的吸光度A与pH值的关系呈S形曲线（图4B）。在240～350 nm范围，图4中的吸收光谱与图3中的荧光激发光谱形状相似，变化趋势相同。

图4A中出现等色点，表明木兰花碱在水溶液中存在两种吸光型体（也是荧光型体）的相互转化，木兰花碱发生了质子电离，表现为一元弱酸。根据图4中的光谱数据，可以用pH值-光度法测定木兰花碱羟基质子的电离常数pKa，计算公式为：

式中， AHL表示弱酸分子全部以分子型體存在时的吸光度（如图4B中pH 2.5附近的A值）， AL表示弱酸分子全部以离子型体存在时的吸光度（如图4B中pH 7.0附近的A值）。将图4B中位于S形曲线中间部分的 pH-A数据代入式（1），计算pKa，结果见表2， 平均值为pKa=4.77。

3.4 木兰花碱的荧光量子产率的测定

按照2.2.2节方法测得木兰花碱水溶液（离子型体）的荧光量子产率为0.19，属于强荧光物质。从分子结构（图1）上看，木兰花碱具有强荧光物质的分子结构特征：具有大的共轭π键结构，图1中A、D两个苯环形成联苯结构，共轭程度较高; 具有刚性平面结构，C环与A、D两环连接，增加了分子的平面性和刚性，其离子型体的C1位氧负离子可能与C11位羟基形成分子内氢键，也使分子的刚性增强; 苯环上的给电子取代基（羟基和甲氧基）具有增强荧光的作用; 从图1和荧光波长为420 nm可以推断，木兰花碱的最低单线电子激发态S1为（π，π*）型，此类跃迁几率高，荧光强度大。

3.5 中药青风藤提取液的三维荧光图谱

青风藤为防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤茎，主治风湿痹痛、关节肿痛等症[27]。在青风藤药材中已发现逾60种化合物，主要包括生物碱类、脂类、甾醇类、萜类、菲类和蒽醌类等[28]，其药效成分主要为吗啡烷类[29，30]和阿朴菲类[31]生物碱。虽然青风藤中的化学成分种类繁多，但其提取液的荧光光谱比较简单（图5）。

图5与图2中，位于λem=420 nm的荧光峰的激发波长和光谱形状基本一致，且随pH值的变化基本相同，可判断为木兰花碱的荧光峰。在图5中，短波处（λem=330～340 nm）的荧光峰推测为吗啡烷类生物碱，此类化合物的分子共轭程度较低，荧光波长较短。在碱性条件下（图5C），木兰花碱荧光峰的λem略有红移，可能是菲类及蒽醌类化合物所致，这些化合物的分子共轭程度较高，荧光波长较长。对比图5和图2可知，如选择在中性水溶液中，激发波长为315 nm时测定木兰花碱的荧光，青风藤中的其它组分基本不干扰。

3.6 青风藤中木兰花碱的荧光法测定

测定不同浓度的木兰花碱系列标准溶液的荧光光谱（图6），荧光强度IF（λex/λem=315 nm/420 nm）与木兰花碱在0.04～1.25 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为IF=6146.8c+ 24.4，相关系数R=0.999（n=11）。以空白信号3倍的标偏差计算方法的检出限为0.52 ng/mL。

在青风藤样品提取液中加入不同体积的木兰花碱标准溶液，加标回收实验结果见表3。回收率在101.2%～102.7%之间。 配制4份不同浓度的青风藤提取液，采用本方法测得木兰花碱的含量平均值为0.63%，相对标准偏差（RSD， n=4）为0.1%。用本方法测定木兰花碱时，如果样品提取液中的其它组分在测量波长下也产生荧光，则会对测定产生干扰。利用LC-MS/MS，测得同一青风藤样品中木兰花碱的含量为0.61%，RSD为2.5%（n=3）。两种方法测定结果基本一致。

4 结 论

木兰花碱水溶液可产生稳定的强荧光，可用于中药样品中木兰花碱的测定。本研究建立的青风藤中木兰花碱的荧光分析新方法具有简便快速、环境友好、灵敏度高、结果可靠等优点， 研究结果为中药和生化样品中木兰花碱的分析测定提供了新思路。

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