固定化蔗糖酶降解大蒜渣多糖的工艺研究

王慧慧 任茂生 李维静

摘要    优化固定化蔗糖酶降解大蒜渣多糖的工艺条件，研究了pH值、温度和流速对酶活性的影响，并进行了正交试验。然后研究不同使用次数后固定化蔗糖酶的活性，测定了酶解前后多糖的相对分子质量。结果表明，固定化提高了蔗糖酶的稳定性和利用率，反应的最适pH值、温度和流速分别为5.0、50 ℃和0.5 mL/min。正交试验结果表明，在pH值5.0、温度60 ℃和流速0.5 mL/min的条件下，固定化酶的催化活力最大，降解后的低聚果糖相对分子质量约为5 000 Da。

关键词    固定化;大蒜渣;蔗糖酶;降解

中图分类号    TS219        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）01-0219-03

Abstract    To optimize the technological conditions of the garlic dreg polysaccharide degradation by immobilized sucrase.The effects of pH value，temperature and flow rate on the activities of immobilized sucrase were studied，and the orthogonal experiment was executed.The activities of the immobilized sucrases with the different usage number were compared，and the relative molecular weights of the garlic dreg polysaccharides were measured before and after degradation.The immobilization increased the stability and efficiency of sucrose，and the optimal reaction pH value，temperature and flow rate were 5.0，50 ℃ and 0.5 mL/min，respectively.The orthogonal experiment showed that the activity of immobilized sucrose was the highest at pH 5.0，60 ℃ and 0.5 mL/min.The relative molecular weight of the degraded fructo-oligosaccharide was about 5 000 Da.

Key words    immobilization;garlic dreg;sucrase;degradation

大蒜渣是大蒜精油加工過程中形成的主要废弃物，由于其含有较多的硫化物，具有较浓烈的刺激性臭味，若不及时处理将会造成严重的环境污染[1]。事实上，蒜渣中含有多种活性物质，如大蒜素、氨基酸、维生素、蛋白质、碳水化合物和微量元素[2]。目前，大蒜渣中多酚[3]、氨基酸[4]和活性肽[5]的提取制备已受到研究者的关注。同时大蒜渣作为一种功能性饲料，可以促进异育鲫鱼的生长，增强动物体内消化酶的活性，提高免疫力[6]。大蒜渣的深度开发不仅可以增加大蒜资源的综合利用率，而且可以解决其对环境的污染问题，具有重要的经济和生态研究意义。

大蒜渣的干物质主要由碳水化合物组成，其中含有大量的果聚糖及少量的中性糖。研究发现，大蒜果聚糖中果糖与葡萄糖的比例约为15∶1，是制备高果糖浆的理想原料[7]。此外，大分子量的果聚糖可被降解成为聚合度（DP）较低的低聚果糖（DP=2～5），其具有改善人体肠道菌群、降血脂、提高人体免疫力和促进矿物元素吸收的功效[8]。多糖的降解方法很多，如酸碱法、超声波法和酶法等，其中酶法由于反应条件温和、特异性强，被广泛地应用于工业生产。果聚糖的降解酶包括蔗糖酶和菊粉酶[9]，其中蔗糖酶（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶，EC3.2.1.26），又称转化酶，能特异性地催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键，将蔗糖转化成糖浆。黄  菁等[10]比较了2种不同蔗糖酶酶解大蒜渣制备果葡糖浆的工艺条件，研究发现，12 h后蔗糖酶的水解率可达80%。在工业生产中，常常利用载体对酶制剂进行固定，固定化不仅可以提高酶制剂的催化活性和稳定性，同时可以反复利用，极大地节约生产成本。本文以固定化的蔗糖酶为对象，主要对固定化蔗糖酶催化降解大蒜果聚糖的工艺条件进行初步研究，以期为大蒜深加工提供一种可行性思路。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    材料和试剂。蔗糖酶购自裕立宝生物公司;葡聚糖凝胶G-200购于源叶生物有限公司;不同分子量的葡聚糖（5.0、25.0、80.0、150.0 kDa）购于Sigma公司;醋酸、无水乙醇、海藻酸钙、葡萄糖、苯酚、硫酸均为分析纯。大蒜籽购于超市。

1.1.2    主要设备。真空旋转蒸发仪、高速离心机、紫外-可见分光光度计、蠕动泵、部分收集器。

1.2    试验方法

1.2.1    大蒜渣多糖的制备。市售的大蒜籽剥皮清洗干净，组织匀浆机粉碎，纱布过滤后得蒜渣，60 ℃鼓风干燥，备用。称取一定量蒜渣，按料液比1∶20（g/mL）加入正己烷，浸泡脱脂12 h。脱脂后的蒜渣干燥后，按料液比1：50（g/mL）加入去离子水，在80 ℃条件下搅拌提取2 h，重复1次。纱布（8层）过滤后得提取液，用真空旋转蒸发仪浓缩至一定体积，5 000 r/min离心10 min，取上清液。向上清液中加入4倍体积的无水乙醇，4 ℃下醇沉过夜。去除上清液，5 000 r/min离心10 min，得沉淀物。用适量去离子水溶解沉淀，Sevag法脱除蛋白3次[11]。适当浓缩，冷冻干燥后得大蒜多糖。

1.2.2    蔗糖酶的固定化。蔗糖酶的固定方法很多，如吸附法、包埋法[15]。在固定过程中，固定介质和工艺对酶的活力影响很大。笔者比较了多种固定方法，发现陈  雄等的方法可以得到类似于球型的颗粒，且固定化酶的活力回收率较高，达到78.3%，是一种较理想的蔗糖酶固定方法。因此，蔗糖酶的固定方法参照陈  雄等[12]的方法。取10 g固定化蔗糖酶与1.5%（质量体积比）蔗糖溶液按1∶10（质量比，pH值5.5）混合，40 ℃下均匀搅拌反应10 min，5 000 r/min离心10 min后取上清液，利用DNS法测定还原糖的量[13]。取与固定化蔗糖酶颗粒等量的游离蔗糖酶，与上述相同质量的蔗糖溶液混合，40 ℃下均匀搅拌反应10 min，DNS法测定还原糖含量。

酶活单位定义：10 g固定化酶1 min催化生成1 μmol还原糖定义为1个酶活单位。固定化蔗糖酶的活力回收率（%）=固定化酶总活力/游离酶总活力×100。

1.2.3    固定化蔗糖酶的稳定性。利用pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制200 mL 2.0%（质量百分比）的大蒜渣多糖溶液，以1.0 mL/min的流速流经装有10 g固定化蔗糖酶的层析柱，12 h后测定底物溶液的还原糖含量，计算酶的活力。用醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗层析柱后，重复使用固定化蔗糖酶进行多糖降解，测定不同使用批次中固定化蔗糖酶的相对活力。

1.2.4    多糖的相对分子量。采用葡聚糖凝胶G-200凝胶排阻法测定大蒜多糖的相对分子质量。层析柱（1.2 cm×70.0 cm）中的凝胶高度为50 cm，多糖样品的浓度为1.0%，上样量2.0 mL，用0.05% NaCl水溶液以0.2 mL/min的速率洗脱，部分收集器以每支试管10 min的速率进行收集。采用苯酚-硫酸法测定试管中的总糖含量[14]，绘制色谱图。

在相同条件下测定不同分子量葡聚糖的出峰时间，对样品的分子量进行估算。

1.2.5    酶催化条件的优化。①pH值。称取10 g固定化蔗糖酶，置于层析柱（1.5 cm×40 cm）中，备用。利用pH值分别为3.0、4.0、5.0和6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液配制200 mL 2.0%（质量百分比）大蒜渣多糖溶液，充分溶解后置于40 ℃水浴中1 h，用蠕动泵将溶液以1.0 mL/min的速度循环流经层析柱，酶解反应12 h。以煮沸后的酶液作对照，利用DNS法测定底物中还原糖的增量，计算出固定化酶的活力。②温度。配制浓度为2.0%、pH值4.0的多糖溶液，分别置于30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中，以1.0 mL/min的流速循环流经层析柱，酶解反应12 h。利用DNS法测定不同温度反应后底物中还原糖的增量，并计算出固定化酶的活力。③流速。配制浓度为2%、pH值4.0的多糖溶液，置于40 ℃水浴中1 h，分别以0.5、1.0、2.0、5.0 mL/min的流速循环流经层析柱，酶解反应12 h。利用DNS法测定不同流速下底物中还原糖的增量，计算出固定化酶的活力。④正交试验。采用L9（34）正交试验对固定化酶降解大蒜渣果聚糖的工艺条件进行优化，正交试验因素与水平见表1。

2    结果与分析

2.1    固定化蔗糖酶的稳定性

由图1可见，固定后的蔗糖酶颗粒可以反复使用，且可以保持一定的活力。当使用次数小于6次，酶的催化活力可达最初活力的50%以上。但当使用次数高于5次，酶的催化活性急剧下降。这可能是由于长时间储藏导致酶活性的下降，或者是底物流经固定酶时间过长导致酶制剂从载体上脱离流失造成的。

2.2    果聚糖的分子量测定

凝胶排阻法是测定大分子相对分子质量的一种常见方法，主要依据不同物质在固定相中流经距离的差异进行分子量的测算。小分子物质流经的距离长，出峰时间越大;反之，大分子的出峰时间较短。

如图2所示，降解前大蒜多糖的出峰时间约为200 min，根据标准品的出峰时间测算，其相对分子质量约在600 kDa以上;降解后的多糖在750 min处出现了一个新峰，根据标准品的出峰时间测算出其相对分子质量约为5 000 Da。该结果进一步证明了固定化蔗糖酶对大蒜渣果聚糖的降解作用。

2.3    固定化蔗糖酶的催化反应条件

2.3.1    pH值。酶促反应体系的pH值与酶的催化中心结构有密切的联系，合适的pH值可以促进酶与底物的结合，从而提高酶的活力。研究比较了不同pH值条件下固定化蔗糖酶的催化活力，結果如图3所示，当pH值在3～5的范围内，固定化蔗糖酶的催化活性随着pH值的升高而增大;当pH 值进一步增大时，酶的活力开始急剧下降，说明蔗糖酶在偏酸性条件下具有较高的活性。

2.3.2    温度。在酶催化过程中，反应体系的温度可以增大底物的热运动，增加底物与酶催化活性中心的结合几率。然而，温度过高时又会造成酶的失活。由图4可见，当温度介于40～55 ℃时，固定化蔗糖酶的活性一直处于一个较高的水平。这可能是由于固定化后酶的结构受到介质的空间束缚，当温度变高时，底物的热运动增强，而酶的结构变化不大，所以酶活性处于较高水平。

2.3.3    流速。与游离酶相比，固定化酶的运动受到了极大的限制。本试验采用填充柱反应器进行多糖的酶降解反应，通过底物的流动增大其与酶的碰撞几率。研究发现，流速小于2.0 mL/min时，酶的催化水平较高;但是当流速进一步增大时，固定蔗糖酶的降解活性显著下降。这一现象可能是由于流速过快导致底物无法与酶催化活性中心稳定结合造成的（图5）。

2.3.4    正交试验。利用正交试验对固定化蔗糖酶催化条件进行了优化，极差分析结果表明，各因素对固定化蔗糖酶活力影响的主次顺序为pH值>流速>温度，最佳的酶解条件为 pH值5.0、温度60 ℃和流速0.5 mL/min（表2）。

方差分析结果表明，反应体系的pH值是影响固定化蔗糖酶催化活性的主要因素，且对酶活性有显著性影响。

3    结论

大蒜渣中含有大量的果聚糖，利用固定化酶对其进行降解，制备成低聚果糖可以提高大蒜加工产品的附加值，同时解决了大蒜渣造成的环境污染问题。本试验以固定化蔗糖酶为对象，主要研究了其降解大蒜渣多糖的工艺条件以及固定化酶的稳定性。单因素结果表明，降解的最适pH值为5.0，温度为50 ℃，流速为0.5 mL/min。正交试验显示在pH值5.0、60 ℃和0.5 mL/min条件下，固定化蔗糖酶的活力达到132 U/100 g，其中反应体系的pH值对固定化蔗糖酶的活性影响显著。葡聚糖凝胶排阻试验结果表明，固定化的蔗糖酶可将相对分子质量较大的大蒜渣多糖降解成相对分子质量约5 000 Da的小分子碳水化合物。此外，固定化蔗糖酶可以反复使用，但是当使用次数大于5次后，酶的活力开始急剧下降。因此，进一步优化固定化方法，提高酶的稳定性将是后面亟待解决的问题。

4    参考文献

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