炒槐花配方颗粒指纹图谱研究△

黄宇，冯健，胡昌江，李文兵

1.四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川 成都 611900；2.国家中医药管理局中药配方颗粒质量与临床疗效评价重点研究室，四川 成都 611900；3.成都中医药大学，四川 成都 611137

槐花为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾，槐花、炒槐花和槐花炭为《中华人民共和国药典》历版均收载的其3种饮片[1]。槐花为中医临床常用的止血药，具有清肝泻火、清热凉血的功效；炒槐花的清热凉血作用弱于槐花，止血作用逊于槐花炭而强于槐花，用于脾胃虚寒的出血患者[2]。槐花主要含芦丁、槲皮素、异鼠李素等黄酮类成分以及鞣质，此外还含有皂苷类、甾类等多种成分[3-4]。炒槐花配方颗粒由槐花经过炮制处理，应用现代制药工艺提取、浓缩、干燥制粒而成。目前，炒槐花配方颗粒的研究未见报道，仅有炒槐花、槐花饮片含量测定、指纹图谱等研究[5-7]，本文建立其特征峰指纹图谱，可以系统地反映炒槐花配方颗粒水溶性化学成分的全貌。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪(G1312B型二元泵、G1315C型DAD检测器)；电子天平BP-211D(Sautoris，德国)；KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)等。

1.2 试药

芦丁对照品、槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为：100080-201409、100081-201610)；甲醇(迪马公司，色谱纯)；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

炒槐花配方颗粒(四川新绿色药业，批号分别为：101001、100102、120301、0908146、0904176、1111015、A111075、A100617、A081883)编号为S1～S9。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇为流动相A，以1%冰醋酸溶液为B，梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

取槲皮素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声(功率：250 W，频率：50 kHz)处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取炒槐花配方颗粒(批号：1111015，下同)精密称定，按照2.2.2的制备方法制备。将制备的供试品溶液，按2.1色谱条件测定，连续进样6次，每次10 μL，4个特征峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.02%；特征峰的相对峰面积RSD为0.00%～0.77%，表明该仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 精密称取炒槐花配方颗粒6份，分别按照2.2.2的制备方法制备。取供试品溶液，按2.1色谱条件测定，所得各特征峰的相对保留时间的RSD值分别为0.00%～0.09%；特征峰的相对峰面积RSD值为0.00%～0.94%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 分别取同一份炒槐花配方颗粒供试品溶液，按2.1色谱条件，分别于0、2、6、12、24 h测定。结果分析，各特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积变化较小，其RSD值分别为0.00%、1.10%、0.33%、0.12%和0.00%、1.90%、1.52%、1.91%，均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 指纹图谱的建立及分析

2.4.1 炒槐花配方颗粒特征图谱的建立 按照2.2样品制备方法和2.1色谱条件，分别对9批炒槐花配方颗粒进行测定，记录70 min的色谱图。根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了4个重复性较好的峰作为特征峰。结果见表2～3，图1～2。结合现代研究表明，芦丁为槐花的主要有效成分，故以芦丁峰(峰1)为参照峰。4个共有峰的平均相对保留时间依次为：1.000、1.197、1.234、1.439，RSD均低于0.1%，具有较好的重复性，可作为炒槐花配方颗粒的特征峰。

表2 9批炒槐花配方颗粒相对保留时间

表3 9批炒槐花配方颗粒相对峰面积比值

图1 炒槐花配方颗粒HPLC指纹图谱共有模式

图2 9批次炒槐花配方颗粒HPLC指纹图谱

2.4.2 炒槐花配方颗粒特征图谱相似度评价 将所得到的数据导入国家药典委员会指定的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，设定参照图谱，将9批次样品中4个共有特征峰自动匹配，生成对照图谱R，进行相似度评价，结果见表4。9批样品的相似度均大于0.9，说明9批炒槐花配方颗粒的质量稳定。

3 讨论

笔者在实验过程中，分别考察了提取溶媒甲醇、70%甲醇、50%甲醇，其中甲醇作为提取溶媒色谱峰最佳，综合考虑，确认甲醇作为提取溶媒。在提取时间上，分别考察了超声提取时间15、30、45 min，结果表明30 min时，炒槐花配方颗粒中主要成分提取充分，故确定提取时间为30 min。

为保证炒槐花配方颗粒的质量一致性[8-9]，笔者对炒槐花炒制工艺进行研究，以芦丁含量和炒制颜色情况为评价指标，分别考察了炒制时间、炒制温度对炒槐花的影响。芦丁含量测定的色谱条件和供试品制备方法均参考《中华人民共和国药典》2015版“槐花”项下检测方法。参考各地饮片炮制规范以及2015版《中华人民共和国药典》“炒槐花”项下炮制要求，最终确定，炒槐花的炮制方法为：取槐花饮片投入炒制容器内中，90 ℃下清炒4～8 min，至表面深黄色时，取出，放凉。

本实验建立了炒槐花配方颗粒的高效液相指纹图谱，系统地反映了其水提物化学成分的全貌，该图谱方法的建立，可作为炒槐花的质量控制方法。通过对炒槐花配方颗粒的分析，共建立4个共有峰，其中指认2个峰分别为芦丁、槲皮素。最终以芦丁特征峰作为参照峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为1.000(峰1，S峰)、1.197(峰2)、1.234(峰3)、1.439(峰4)。结合峰2、峰3的紫外吸收光谱图，初步判断峰2、峰3均为黄酮类成分，后期将继续开展其成分确认研究。

表4 9批次炒槐花配方颗粒HPLC指纹图谱相似度评价结果

采用本实验建立的高效液相指纹图谱方法，分别对槐花配方颗粒和炒槐花配方颗粒进行比较，发现在3.8 min左右炒槐花配方颗粒较槐花配方颗粒多出1个峰，该峰的最大吸收波长为286 nm，充分说明槐花在炮制前后成分发生了变化，该峰亦可用于两者的鉴别。