树鼩Mfsd2a基因的克隆分析和不同组织表达量的检测

王文广, 匡德宣, 李 娜, 陆彩霞, 罕园园, 仝品芬, 孙晓梅, 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室、中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队, 昆明 650118）

主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a, Mfsd2a), 是一种膜转运蛋白，属于次级转运蛋白的主要促进因子超家族[1]。研究表明, 它与血脑屏障(BBB)的跨膜运输功能相关, 可抑制脑微血管内皮细胞跨膜胞吞转运[2]，可作为受体介导二十二碳六烯酸(DHA)进入BBB[3]，此外还可能与机体生长发育相关[4]。Mfsd2a是神经系统尤其是BBB中的一个重要角色, 进行Mfsd2a的功能探讨对神经系统疾病的机制研究和临床治疗具有重要意义。

树鼩与人有较近的亲缘关系，先后被用于免疫系统[5]、消化系统[6]、泌尿系统[7]和生殖系统[8]等方面的研究，实际上树鼩的中枢神经系统也相当发达，脑体重比与人极为接近[9]，比较适合神经科学方面的研究，已经先后有人用树鼩开展神经系统疾病的研究，如树鼩脑缺血可导致海马BBB通透性增高，而海马微环境紊乱对BBB通透性具有促进作用[10]，而银杏内酯B(GB)对异常微环境中的海马神经元具有一定的保护作用[11]。Ma等[12]对树鼩注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)后发现，树鼩表现出了类似人类帕金森病的各种症状，显示树鼩可用于研究帕金森病发病机制研究。欧阳轶强等[13]采用腹腔注射D氨基半乳糖胺(D-gal)、双侧海马注射β-淀粉样肽1-42(Aβ1-42)和鹅膏蕈氨酸(IBO)混合液的方法，探索建立阿尔茨海默病树鼩模型，可以造成树鼩学习记忆能力下降，并出现神经胶质细胞增生和神经纤维缠结。也先后有人对树鼩的海马神经干细胞[14]和多巴胺神经细胞[15]进行了成功的分离培养，以便开展体外实验研究。

上述研究显示树鼩在神经系统疾病研究方面有很大的应用潜能, 本研究通过克隆测序和生物学信息学分析以及不同组织表达量的检测, 对树鼩的Mfsd2a基因结构、定位及表达进行分析, 为深入研究其在血脑屏障相关神经系统疾病中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1岁龄雄性树鼩，体质量130 g，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供[SCXK(滇) K2018-0002]，在本中心实验室解剖取材[SYXK(滇)K2018-0002]。

1.2 主要试剂和仪器

总 RNA 提取试剂RNAiso Plus、逆转录试剂盒PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PCR扩增试剂盒Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0)和一步法qPCR试剂盒One Step TB GreenTMPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit均购自日本TaKaRa公司，分子量标准RealBand DNA Marker (100～10000 bp)购自我国BBI 公司。

CFX 96实时荧光定量PCR仪、MyCycler PCR仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统、PowerPac Universal电泳仪和Sub-Cell水平电泳槽均购自美国Bio-Rad公司; NanoDrop ND1000紫外可见分光光度计购自美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计与合成 根据NCBI上公布的树鼩Mfsd2a基因预测序列(XM_027766873.1、XM_014582722.2、XM_027766873.1、XM_027766875.1、XM_027766876.1)设计引物，目的片段预期全长1 796 bp, 交由宝生物公司合成。正向： 5'-GAACCRAAAAAGAAGAAACAACAGT-3'反向： 5'-ACAGACATATACATACACACAYATTGCT-3'

1.3.2 总RNA的提取和cDNA的合成 参考文献报道的Mfsd2a在中枢神经系统中分布较高的特性[2]，目的基因的克隆选择树鼩的脑和脊髓组织，按RNAiso Plus试剂说明提取组织中的总RNA，采用分光光度计法及电泳法检测RNA纯度和完整性，按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明进行反转录反应。

1.3.3 目的基因的扩增和测序 以1.3.2反转录的cDNA为模板, 按Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0)说明进行PCR反应，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经过电泳鉴定合格后，送上海生工生物公司测序。

1.3.4 测序结果的生物信息学分析 测序结果应用NCBI的在线BLAST程序和CDD工具进行同源性分析; 应用Mega 7.0软件构建系统进化树; 应用EXPASY的Protaram软件在线分析编码蛋白的氨基酸组成、理论分子质量和等电点; 利用NPS@MLRC对蛋白的二级结构进行预测; 利用TMHMM和OCTOPUS在线分析蛋白的跨膜分布情况; 利用SMART 程序和InterProScan扫描分析可能存在的蛋白结构域; 利用SignlP 程序进行蛋白质N-末端信号肽预测; 利用Expasy的ProtScale预测蛋白的亲疏水性; 利用SWISSMODEL预测蛋白的三级结构; 利用NetNGlyc 1. 0 在线软件分析糖基化位点; 利用PSORT Ⅱ中k-NN程序预测蛋白的亚细胞定位。

1.3.5 不同组织中MFSD2A基因表达量的检测 按RNAiso Plus试剂说明提取树鼩心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大脑和脊髓8种组织的总RNA，以树鼩β-actin为内参，按照One Step TB GreenTMPrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit说明进行实时荧光定量PCR，各组织中Mfsd2a的相对表达量以2-△△Ct计。树鼩β-actin的引物根据NCBI上公布的序列(KC215183.1)设计，Mfsd2a的引物根据测序结果设计。

2 结果

2.1 目的基因的克隆与鉴定

提取树鼩的脑和脊髓组织的总RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测合格(图1); 特异性扩增后的产物大小1 500～2 000 bp(图2)，与预期的 1 796 bp吻合。

2.2 树鼩Mfsd2a基因的同源性分析和系统进化树构建

图1 树鼩脑和脊髓总RNA电泳结果Figure 1 Electrophoresis results of the total RNA from the brain and spinal cord of tree shrew

对克隆的目的基因测序，拼接后获得1 796 bp的序列(图3)，与预期长度一致。将所得树鼩Mfsd2a基因序列在NCBI上进行比对, BLAST结果显示, 其与树鼩Mfsd2a预测序列(XM_027766876.1)高度一致(99.35%)，与人(BC092414.1)、猕猴(XM_011763623.1)、兔(XM_017346426.1)、大鼠(NM_001106683.1)和小鼠(NM_029662.2)的相似度分别为85.80%、85.96%、88.21%、83.84%和83.72%; 将序列经NCBI的CDD工具分析, 成功匹配到MFS超家族(图4); 该序列编码区全长1464 bp,编码488个氨基酸，将其蛋白序列通过NCBI进行BLAST，选取同源性较高的几个不同物种的蛋白序列，通过Mega 7.0的NJ法构建系统进化树(图5)，树鼩Mfsd2a编码蛋白序列与NCBI中的树鼩序列(ELV12385.1)同属一支，与人和猕猴的遗传距离比兔、大鼠和小鼠更为接近。

图2 树鼩Mfsd2a基因PCR结果Figure 2 PCR results of the tree shrew Mfsd2a gene

图3 树鼩Mfsd2a基因序列及编码氨基酸序列Figure 3 Tree shrew Mfsd2a gene sequence and the predicted coding amino acid sequence

图4 树鼩Mfsd2a基因序列的CDD分析Figure 4 CDD analysis of tree shrew Mfsd2a gene sequence

图5 Mfsd2a蛋白序列在不同物种中的系统进化树Figure 5 Phylogenetic tree of Mfsd2a protein sequence in different species

2.3 树鼩Mfsd2a蛋白氨基酸组成分析

利用ExPASy中的Protaram 在线软件分析树鼩Mfsd2a蛋白氨基酸序列，推测其蛋白分子量为53 803.75 Da，氨基酸种类20种，等电点为5.58，亲水性的平均值(GRAVY)为0.511。其氨基酸种类的含量相对比较均匀，其中亮氨酸(12.5%)、丙氨酸(9.8%)、丝氨酸(7.8%)、苯丙氨酸(7.4%)、缬氨酸(7.4%)、苏氨酸(6.8%)、异亮氨酸(6.6%)和甘氨酸(6.4%)的含量相对较高。

2.4 树鼩Mfsd2a蛋白信号肽分析和跨膜结构预测

利用SignlP 程序进行蛋白质N-末端信号肽预测，如图6所示，该蛋白无信号肽; 跨膜结构分别通过TMHMM和OCTOPUS在线预测，其中TMHMM预测有10个跨膜结构(图7A)，OCTOPUS在线预测有12个跨膜结构(图7B)，两种软件预测的结果存在差异，提示其跨膜结构可能存在一定的变数，但仍然与MFS超家族通常有10～12个跨膜结构域的特性相符。

2.5 树鼩Mfsd2a蛋白的亲疏水性分析

应用Expasy Protscale在线分析软件，预测树鼩Mfsd2a蛋白的亲疏水性，结果如图8所示，其中正值表示疏水性，而负值表示亲水性。从图中可以看出，正负区域均有相当的氨基酸分布，其中正区分布稍多，与此前ExPASy Protaram预测其亲疏水性的平均值(GRAVY)为0.511一致，表明树鼩Mfsd2a蛋白具有较强的疏水性。

2.6 树鼩Mfsd2a蛋白的二级结构预测

蛋白的二级结构利用NPS@MLRC在线分析系统预测(图9)，结果显示，树鼩Mfsd2a蛋白中α-螺旋(h表示)占51.02%，β-折叠(t表示)占1.84%，氨基酸残基构成的延伸链(e表示)占15.37%，无规卷曲(c表示)占31.76%。

图6 树鼩Mfsd2a蛋白的信号肽预测Figure 6 Signal peptide prediction of tree shrew Mfsd2a protein

图7 树鼩Mfsd2a蛋白的跨膜结构Figure 7 Transmembrane structure of tree shrew Mfsd2a protein

图8 树鼩Mfsd2a蛋白的亲疏水性分析Figure 8 Analysis of the hydrophobicity of tree shrew Mfsd2a protein

图9 树鼩Mfsd2a蛋白的二级结构预测Figure 9 Secondary structure prediction of tree shrew Mfsd2a protein

2.7 树鼩Mfsd2a蛋白的结构域和三级结构预测

使用SMART 程序预测了树鼩Mfsd2a蛋白的结构域，结果显示蛋白存在主要促进调解超家族特有的结构域Pfam MFS_2(图10A), 通过InterProScan工具扫描序列以匹配InterPro蛋白质签名数据库，也发现其与MFS转运蛋白超家族同源(图10B)。进一步利用SWISS-MODEL在线分析平台进行蛋白三级结构预测，树鼩与人Mfsd2a蛋白的三级结构基本相似，存在4处细微差异(图11)。

2.8 树鼩Mfsd2a蛋白修饰结构的预测和亚细胞定位分析

通过NetNGlyc 1.0软件在线分析，预测到树鼩Mfsd2a蛋白在第175、185位氨基酸处分别存在1个N糖基化位点(图12)。利用PSORT II的k-NN分析程序预测该蛋白亚细胞可能分布情况，结果显示65.2%分布于细胞膜，26.1%分布于内质网，4.3%分布于线粒体，4.3%分布于高尔基体。

图10 树鼩Mfsd2a的蛋白结构域预测Figure 10 The protein domain prediction of tree shrew Mfsd2a

图11 Mfsd2a蛋白的三级结构预测Figure 11 Tertiary structure prediction of Mfsd2a protein

图12 树鼩Mfsd2a蛋白N糖基化位点分析Figure 12 N-glycosylationsites analysis of tree shrew Mfsd2a protein

2.9 树鼩不同组织中Mfsd2a基因的表达情况

以β-actin基因为内参基因，qPCR方法检测Mfsd2a基因在树鼩心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大脑和脊髓中的表达情况，qPCR结果如图13所示，扩增曲线均呈现典型的“S”型，表明反应体系和扩增程序合适，熔解曲线分析显示引物特异性好，其中β-actin在86 ℃出现均一的单峰，Mfsd2a在85 ℃出现均一单峰结果。均一化处理后的结果显示Mfsd2a基因在8种组织中的表达存在较大差异，其中在大脑、脊髓中的表达量较高，肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、心脏次之，肌肉中最低(图14)。

图13 qPCR的扩增曲线和熔解曲线Figure 13 Amplification curve and melting curve of qPCR

图14 树鼩不同组织中Mfsd2a基因表达情况Figure 14 Expression of Mfsd2a gene in different tissues of tree shrew

3 讨论

Mfsd2a属于主要促进因子超家族(MFS)成员，这个超家族是一个庞大且多样化的运输群体，包括单向转运者、同向转运者和反向转运者。单向转运者运输单个基质，而同向转运者和反向转运者分别以相同或相反的方向跨膜运输两个基质。MFS蛋白可促进多种底物的跨膜转运，包括离子、糖、药物分子、神经递质、氨基酸和肽。MFS蛋白的长度通常为400～600个氨基酸，并且大多数含有10～12个跨膜螺旋结构，并拥有其独特的折叠方式(MFS折叠)[16]。

本研究克隆了树鼩的Mfsd2a基因，经测序获得了1 796 bp的预期全长序列，利用NCBI的CDD分析工具成功匹配到MFS超家族。经NCBI的BLAST分析以及系统进化树构建，发现树鼩的Mfsd2a基因和蛋白与人、猕猴以及大、小鼠等具有较高的同源性，显示其在不同物种具有较高的保守性。其序列的1～1 464 bp可连续编码488个氨基酸，使用SMART 程序预测发现该蛋白存在主要促进调解超家族特有的结构域Pfam MFS_2，通过InterProScan工具扫描也发现其与MFS转运蛋白超家族同源。二级结构预测树鼩Mfsd2a蛋白含较多的α-螺旋(51.02%)，TMHMM预测树鼩Mfsd2a有10个跨膜结构，OCTOPUS在线预测有12个跨膜结构，虽然两种软件结果不一致，但仍与MFS超家族普遍存在10～12个跨膜结构的特性相符。预测发现该蛋白具有较强的疏水性，但亲水区和疏水区均有相当的蛋白分布，预示着其膜蛋白的特性与其存在较多跨膜结构一致。预测树鼩与人Mfsd2a蛋白的三级结构大体相似，存在细微差别。此外预测树鼩Mfsd2a蛋白存在2个N糖基化位点，翻译后的糖基化修饰可能与其转运功能相关。亚细胞定位预测显示，该蛋白主要分布于细胞膜(65.2%)和内质网(26.1%)，也与其功能相符。以上实验数据和分析结果表明，本研究已成功完成树鼩Mfsd2a基因的克隆和生物信息学分析。

Mfsd2a功能的探索最早开始于胚胎发育中，研究证明Mfsd2a是人类syncytin-2的受体[17];Nguyen等[2]揭示了Mfsd2a能以溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)的形式向脑运输ω-3脂肪酸; Ben-Zvi等[3]确定了Mfsd2a通过抑制中枢神经系统内皮细胞的胞吞作用，从而调节脑血浆成分向大脑转移的机制。Yang等[18]通过小鼠颅内出血模型研究, 发现Mfsd2a能通过抑制囊泡转胞吞作用，减轻由血脑屏障破坏引起的脑出血。Berger等[4]通过Mfsd2a基因敲除小鼠模型研究发现，Mfsd2a还是一个营养调节基因，在身体生长发育、运动功能和脂质代谢中发挥着重要的作用。

通过对组织分布情况研究表明，Mfsd2a可在肝脏、脑桥、脑胼胝体、脊髓、小脑等组织中表达，尤其高表达于构成BBB的脑微血管内皮细胞中[2]。本研究以β-actin为内参，对8种不同的树鼩组织中Mfsd2a基因的表达量进行了qPCR检测，结果显示Mfsd2a基因在树鼩的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大脑和脊髓中均有表达，其中在大脑、脊髓中的表达量相对较高，与文献报道基本一致。鉴于树鼩在神经系统疾病模型方面有着巨大的开发潜力，本研究的实验数据和检测方法可为树鼩Mfsd2a的功能探索提供参考。