UbcH10在肝癌中的表达及其与预后的关系

田明 常伟平

摘要：目的  探讨UbcH10在肝癌中的临床病理特征及预后意义。方法  采用RT-PCR技术对我院2017年9月～12月收治的30例不同分化程度肝癌患者肿瘤组织中的UbcH10表达进行检测，通过Kaplan-Meier和 Cox回归评估UbcH10表达与患者存活率的相关性。结果  低分化肝癌组织中UbcH10 mRNA表达EI评分为（0.82±0.32）分，高于高分化癌组织的（0.33±0.06）分，差异有统计学意义（P<0.05）;不同组织学分化程度和淋巴结转移患者的UbcH10表达比较，差异有统计学意义（P<0.05）;高UbcH10表达和低UbcH10表达的肝癌患者的存活时间不同，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  UbcH10可能在肿瘤发展中起积极作用，可作为肝癌患者预后不良的独立预测因子。

关键词：UbcH10;肝癌;预后

中图分类号：R735.7                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.12.024

文章编号：1006-1959（2019）12-0077-03

Abstract：Objective  To investigate the clinicopathological features and prognostic significance of UbcH10 in hepatocellular carcinoma. Methods  The expression of UbcH10 in tumor tissues of 30 patients with different degrees of differentiation from September to December 2017 was detected by RT-PCR.Correlation between UbcH10 expression and patient survival was assessed by Kaplan-Meier and Cox regression. Results  The EI score of UbcH10 mRNA expression in poorly differentiated liver cancer tissues was （0.82±0.32）， which was higher than that in well differentiated cancer tissues（0.33±0.06）， the difference was statistically significant （P<0.05）.The difference of UbcH10 expression between patients with different histological differentiation and lymph node metastasis was statistically significant （P<0.05）. The survival time of patients with high UbcH10 expression and low UbcH10 expression was different，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  UbcH10 may play an active role in tumor development and may be an independent predictor of poor prognosis in patients with liver cancer.

Key words：UbcH10;Liver cancer;Prognosis

肝癌（liver cancer）是我國高发的、危害极大的恶性肿瘤之一。有数据统计，肝癌患者的平均5年生存率仅为4%[1]。肝癌患者一般确诊时已至晚期，临床治疗手段非常有限，患者预后极差[2]。目前，肝癌的预后生物标志物相对缺乏，寻找有效的预后标记具有重大意义。在本研究主要探讨肝癌组织中UbcH10的表达及其与临床病理特征的关系，分析肝癌患者UbcH10的表达与生存率相关性的，旨在寻找肝癌患者预后不良的独立预测因子。

1资料与方法

1.1一般资料  收集2017年9月～12月在西安医学院第一附属医院就诊，接受手术切除术或组织活检的肝癌患者30例，其中男性18 例，女性12例，年龄31～81 岁，中位年龄59年。所有患者术前均进行了超声检查和计算机断层扫描。21例患者中行根治性切除，9例患者接受了姑息性手术，手术前后均未进行化疗或放疗。根据世界卫生组织的分类，8例高分化肿瘤，22例为中度或低分化肿瘤。本研获得患者同意并获得研究所研究伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1 RNA提取和实时定量RT-PCR  在取得组织样本后在液氮中快速冷冻， -80℃下储存。通过RT-PCR技术检测30例肝癌组织中的UbcH10基因表达。根据说明书（TRIzol，Invitrogen，USA）提取总RNA。将RNA（2 μg）逆转录成cDNA（Promega，Madison，WI）。使用Mastercycler   ep realplex （Eppendorf， Hamburg， Germany）和IQTM SYBR Green SupermixKit（BIORAD，Berkeley，CA）根据制造商的方案评估定量UbcH10 mRNA水平。GAPDH用作内部对照。qPCR引物如下：UbcH10，有义5'-GGCCCC TTTGGCCAAATGATTAATTACTTAC-3和反义5'-GTTGCCAATTGGACTTGAAGCTTCAATT-3';GAPDH，感觉5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'和反义5'- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。循环条件如下：95℃ 2 min，然后40个循环95℃ 15 s，59℃ 30 s和72℃ 45 s，最终延伸72℃ 5 min。每个反应一式三份进行。UbcH10的表达水平表示为2-△△CT，其中ΔCt=Ct（UbcH10）-Ct（GAPDH）。

1.2.2免疫组化分析  通过免疫组织化学证实检测肝癌组织中的UbcH10蛋白表达。使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物方法固定，石蜡包埋，3 μm厚的组织切片。将切片脱石蜡并使用分级系列的乙醇溶液脱水。通过与0.3%氢过氧化物酶和甲醇一起温育20 min来终止内源过氧化物酶活性。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中漂洗后，将组织切片在耐热塑料容器内的0.01 M柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0） 中处理。然后将切片在家用微波炉中照射20 min微波辐射后，使载玻片在室温下冷却。第一抗体是对UbcH1 特异的兔抗体（1：15， Atlas Antibodies，Sigma-Aldrich，USA）。将切片与一抗孵育过夜4℃，然后使用二抗，用二氨基联苯胺显示结果。由两名在免疫组织化学方面经验丰富的独立观察者载玻片，使用基于染色程度的视觉分级系统对UbcH10表达进行定量分析。阳性肿瘤细胞的百分比分级为0～3： 0=阴性，1=1%～30%，2=31%～60%，3>60%。染色强度分级为0～3：0=无，1=弱染色，2=中度染色，3=强染色。程度（E）和强度（I）的组合通过E×I的乘积获得染色，每个斑点从0～9变化。计算每个肝癌样本的平均EI得分。EI 评分在0～3分为低表达，EI评分>3分为高表达。

1.3统计学方法  所有数据均使用SPSS 13.0统计软件包处理，？字2检验和Fisher精确检验用于分析UbcH10表达与临床病理特征之间的关系，使用Kaplan-Meier方法绘制存活曲线，使用对数秩检验比较UbcH10表达的情况，Cox比例风险模型评估存活情况。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 UbcH10基因在高低分化组织中的表达  低分化肝癌组织中UbcH10 mRNA表达EI评分为（0.82±0.32）分，高于高分化癌组织的（0.33±0.06）分，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2 UbcH10基因表达与肝癌的临床病理学特征之间的关系分析  不同UbcH10表达肝癌患者的年龄、性别、手术类型比较，差异无统计学意义（P>0.05）;不同UbcH10表达肝癌患者组织学分化程度、淋巴结是否转移比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3肝癌患者的总生存率与UbcH10表达水平的关系  高UbcH10表达和低UbcH10表达肝癌患者间的存活时间比较，差异有统计学意义（P<0.05），与低UbcH10表达组相比，高UbcH10表达肝癌患者的存活期较短，见图2。

3讨论

肝癌标志物检测是对影像学及病理学诊断有益的补充，目前肝癌标志物检测主要目的在于提前发现肿瘤或肿瘤的复发、转移，以便及时治疗，但是能够提示患者预后的标志物较少。AFP异质体是一种新型的肝癌标志物，其含量高低与肝癌的分化程度密切相关，是目前临床应用最广泛的肝癌检测标志物，Marrero JA等[3]研究显示，相比肝硬化患者，AFP能更好的检测肝癌，另外，TGF-β也可以作为检测肝癌有效手段之一。Yi X[4]等研究指出，AFP-L3 诊断肝癌的灵敏度为48.3%，特异度为92.9%，因其早期诊断肝细胞癌的灵敏度和特异度均较高，可作为肝癌细胞患者早期诊断的指标之一。

UbcH10是泛素结合酶家族的成员，是泛素-蛋白酶体介导的蛋白质降解途径的关键介质。大量证据表明，UbcH10在各种类型的恶性肿瘤中异常过表达，包括乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、食道癌、淋巴瘤、结肠癌、肝细胞癌和前列腺癌[5-8]。本次研究中，在中低分化肝癌组织中，UbcH10的基因表达水平高于高分化肝癌组织（P<0.05）。在调查了肝癌中UbcH10的表达及其与临床病理特征的相关性，结果显示UbcH10表达上调与组织学分化程度和淋巴结转移密切相关。此外，本研究还发现高UbcH10表达的肝癌患者存活持续时间短于低UbcH10 表达患者，这些结果均提示UbcH10可能作为肝癌预后的优良标志物，其可成为目前肝癌肿瘤标记物研究有益的补充。

本次研究结果显示，UbcH10表达水平在不同手术类型患者之间比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明可能需要更多的肝癌组织样本来评估UbcH10过表达与手术类型之间的关系。

总之，本研究可证明UbcH10表达与肝癌患者预后高度相关，UbcH10可能作为肝癌患者肿瘤治疗的预后标志物和潜在分子靶点。

参考文献：

[1]Naoki O，Tosiaki M，Makiko Y，et al.Quantitative Assessment of Tissue Perfusion in Hepatocellular Carcinoma Using Perflubutane Dynamic Contrast-Enhanced Ultrasonography：A Preliminary Study[J].Diagnostics，2015，5（2）：210-218.

[2]Lee CW，Tsai HI，Cheng HT，et al.Stapleless laparoscopic left lateral sectionectomy for hepatocellular carcinoma：reappraisal of the Louisville statement by a young liver surgeon[J].BMC Gastroenterol，2018，18（1）：178.

[3]Marrero JA，Feng Z，Wang Y，et al.Alpha-fetoprotein in early hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology，2010，138（1）：400-401.

[4]Yi X，Yu S，Bao Y.Alpha-fetoprotein-L3 in hepatocellular carcinoma：A meta-analysis[J].Clinica Chimica Acta，2013（425）：212-220.

[5]Pellino G，Pallante P，Malapelle U，et al.UbcH10 overexpression is less pronounced in older colorectal cancer patients[J].International Journal of Colorectal Disease，2016，31（7）：1367-1368.

[6]Cacciola NA，Calabrese C，Malapelle U，et al.UbcH10 expression can predict prognosis and sensitivity to the antineoplastic treatment for colorectal cancer patients[J].Mol Carcinog，2016，55（5）：793-807.

[7]Wang C，Pan Y H，Shan M，et al.Knockdown of UbcH10 Enhances the Chemosensitivity of Dual Drug Resistant Breast Cancer Cells to Epirubicin and Docetaxel[J].International Journal of Molecular Sciences，2015，16（3）：4698-4712.

[8]Li SZ，Song Y，Zhang HH，et al.UbcH10 overexpression increases carcinogenesis and blocks ALLN susceptibility in colorectal cancer[J].Sci Rep，2014（4）：6910.

收稿日期：2019-3-10;修回日期：2019-4-28

編辑/成森