现代月季6个品种花粉超低温保存研究

李泽迪，杜 莹，姜雪茹，鲁月秀，任瑞芬，张逸璇，刘 燕*

(1.北京林业大学园林学院,花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室,国家花卉工程技术研究中心,城乡生态环境北京实验室，北京 100083；2.北京植物园，北京 100093)

【研究意义】杂交育种是月季培育新品种的重要手段[1]。已知的2万多个现代月季栽培品种中，有80 %是通过品种间反复杂交获得的[2]。因此花粉成为培育新品种的关键因子之一。在自然状态下，月季花粉寿命较短，已有研究表明常温下许多品种不超过5 d，在0～5 ℃恒温冰箱冷藏的花粉活力可以保持10 d[3]。因此月季花粉的长期保存研究有重要的意义，不仅可以解决月季杂交育种中花期不遇和地域障碍等问题，也是种质资源保存的一条途径[4]。但是月季花粉保存研究鲜见报道。【前人研究进展】超低温保存是近几十年发展起来的新技术，是实现花粉长期保存的有效途径[5]。目前已在果树[6]、农作物[7-8]和多种园林植物花粉保存中广泛应用[9-10]，花粉贮存寿命可达10年以上仍然有授粉结实能力[11]。蔷薇属4种植物花粉不同贮存方法研究显示，虽然超低温保存没有成功，但它仍然是彻底解决多数花粉贮存的有效途径，该技术在月季花粉保存中需要进一步研究[12]。【本研究切入点】花粉超低温保存成败评价受多种因素影响，与花粉基因型、含水量、萌发培养等密切相关。本试验以6个现代月季品种花粉为试材，研究不同浓度蔗糖、硼酸组合对花粉萌发的影响，筛选适合花粉离体萌发的适宜培养液；采用扫描电子显微镜观察6个品种花粉形态；在此基础上对采自不同季节的花粉进行超低温保存。【拟解决的关键问题】旨在探索超低温保存技术应用于月季花粉保存的可行性以及花粉形态、采收季节、含水量对花粉超低温保存效果的影响，为月季花粉长期保存提供新的技术途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6个现代月季品种为 ‘金凤凰’、‘金玛丽’、‘伦特娜’、‘仙境’、‘希望’、‘雨果’。其花粉于2017年10月(秋季，气温为8～19 ℃)和2018年5月(春季，气温为17～29 ℃)采自北京植物园月季圃。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉采集 于晴朗无风的上午(9:00-12:00)，采收次日即将开放的花蕾，装入硫酸纸袋，带回实验室后立即用干净的镊子将花药从花蕾中取出，均匀平铺在硫酸纸上，待24 h后花药自然开裂，花粉散出，过细孔筛收集花粉备用。

1.2.2 花粉含水量测定 烘箱干燥法测定花粉含水量。取干燥并置于干燥器中的称量瓶，测定重量记为a；取0.05 g的新鲜花粉置于称量瓶中，测定总重记为b；打开瓶盖放入烘箱中保持103 ℃烘干4 h后封盖放入干燥器中冷却；称量花粉与称量瓶的总重，反复烘干，冷却后称重，直至恒重，记为c。以鲜重为基数计算花粉含水量，花粉自然含水量=(b-c)/(b-a)×100 %。每个处理重复3次，取均值。

1.2.3 花粉离体萌发 采用悬滴法进行花粉离体萌发。在盖玻片上滴适量培养液，将花粉均匀置于液滴上，翻转盖玻片放在凹槽载玻片上，将凹槽载玻片放置在铺有吸满水脱脂棉的培养皿上，在25 ℃光照培养箱中培养4 h后于显微镜下统计萌发数。花粉管长度超过花粉粒直径的2倍记为花粉萌发。花粉萌发率=萌发花粉数/总花粉数×100 %。每个处理设4个重复，每个重复随机选取3个视野进行统计，取均值。

1.2.4 花粉离体萌发适宜培养液筛选 采用两因素全面试验设计。蔗糖浓度设置0 %、5 %、10 %、15 %、20 %(w/v)5个水平，硼酸浓度设置0 %、0.01 %、0.05 %、0.10 %(w/v)4个水平，共20个不同配方，每个配方设4次重复，进行花粉悬滴培养，根据花粉萌发率筛选最适宜培养基。

1.2.5 花粉超低温保存 取0.1 g花粉，将花粉用铝箔纸包好后装入2 mL冻存管，直接投入液氮中保存；1月后检测时取出冻存管，立即于自来水冲洗化冻3 min，再于25 ℃水中化冻20 min，然后进行花粉萌发率测定。

1.2.6 花粉形态观察 取少许花粉均匀掸落在粘有电容胶的样品台上，真空状态下在离子溅射仪中喷金，将处理好的样品置于Quanta 200环境扫描电镜下观察，在合适比例下观察花粉的极面观、赤道观形状及花粉外壁纹饰并拍照。随机选取20粒花粉测量花粉极轴长、赤道轴长、条脊宽、条脊间距以及萌发沟等相关数据，取均值。

1.3 数据分析

数据使用Excel进行整理，采用SPSS21.0软件进行统计学分析，显著水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 花粉萌发适宜培养基筛选

采用悬滴法将秋季采收的6个品种的花粉在不同蔗糖和硼酸组成的培养液中萌发，不同培养基、不同品种的花粉萌发率从0～24.3 %不等(表1)。蔗糖和硼酸浓度明显影响花粉萌发。6个品种最高和次高萌发率都分别出现在15 %蔗糖 + 0.05 %硼酸和10 %蔗糖 + 0.05 %硼酸，与其他浓度配方相比花粉萌发率差异显著。结果表明，此浓度范围内的蔗糖和硼酸营养液配比，比较适宜这些月季品种花粉萌发。‘金凤凰’和‘雨果’在15 %蔗糖 + 0.05 %硼酸培养基中萌发率显著高于10 %蔗糖 + 0.05 %硼酸，但其他4个品种，这2种培养液萌发结果差异不显著。

表1 6个月季品种花粉在不同浓度蔗糖和硼酸组合培养液中的萌发率Table 1 Germination rates of 6 rose cultivars in different concentrations of sucrose and boric acid combination liquid culture

注：表中萌发率数据表示为4个重复的平均值±标准误，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：The data of germination rate in the table showed that there were the mean of four replicates ± standard error, and different letters within same column indicate significant difference atP<0.05.

虽然不同品种在不同培养液中萌发率不同，但是有较高一致性，6个品种的花粉均在15 %蔗糖 + 0.05 %硼酸萌发率最高，因此，适合用做检测这几个月季品种花粉的生活力。

2.2 6个品种花粉自然含水量

用烘干法测定室内自然散粉的花粉含水量，6个品种、不同季节花粉含水量测定结果见表2。

春季采收的花粉含水量为9.6 %～11.9 %；秋季采收的花粉含水量为9.2 %～11.5 %。同一品种不同季节花粉含水量变化因品种而异，‘金玛丽’、‘希望’、‘雨果’和‘伦特娜’4个品种春、秋两季采收的花粉含水量没有显著差异；而‘仙境’和‘金凤凰’两季花粉含水量显著不同，但含水量变化值相差不大，春季采收的‘仙境’花粉含水量高于秋季2.4 %，而‘金凤凰’低于秋季1.6 %。

2.3 6个月季品种花粉超低温保存结果

由表3显示，春、秋季采收的花粉经过液氮保存后均能正常萌发；不同品种、不同季节采收的花粉液氮保存1个月后萌发率为10.36 %～21.28 %，为新鲜花粉的59.3 %到133.9 %不等，表明这6个月季品种的花粉可以采用超低温方法保存。

不同品种新鲜花粉萌发率不同，春季采收的花粉从8.91 %～27.07 %不等，秋季采收的花粉从9.95 %～24.32 %不等；其中‘金凤凰’、‘仙境’、‘伦特娜’3个品种春、秋季新鲜花粉萌发率显著不同，春季花粉萌发率分别高于秋季花粉2.75 %、6.67 %和7.98 %；另外3个品种春、秋季新鲜花粉萌发率无显著差异。结果表明，整体看春季新鲜花粉萌发率高于秋季。从春、秋采收的花粉超低温保存后萌发率看，3个品种春季花粉显著高于秋季，3个品种差异不显著，整体看，春季花粉超低温保存后萌发率较高。

表2 6个月季品种的自然含水量Table 2 Natural moisture content of 6 rose cultivars

注：表中数据表示3个重复的平均值±标准差，同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：The data of moisture content in the table showed that there were the mean of three replicates ± standard deviation, and different letters within same row indicate significant difference atP<0.05.

表3 超低温保存前后6个月季品种花粉萌发率Table 3 Pollen germination rate of 6 rose cultivars pollens before and after cryopreservation

注：表中萌发率数据表示为4个重复的平均值±标准误，同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：The data of germination rate in the table showed that there were the mean of four replicates ± standard error, and different letters within same row indicate significant difference atP<0.05.

超低温保存前后花粉萌发率呈3种变化趋势：保持不变、升高和降低，花粉变化趋势与品种和采收季节有关。同品种不同季节的花粉液氮保存前后变化趋势基本一致，不同的是春季花粉萌发率变化差异显著，其中‘仙境’、‘伦特娜’和‘雨果’2个季节采收的花粉，液氮保存后萌发率没有显著变化；‘金凤凰’2个季节采收的花粉液氮保存后均显著下降，分别下降6.55 %和9.90 %；‘希望’春季花粉液氮保存后萌发率下降3.06 %，‘金玛丽’春季花粉液氮保存后萌发率升高3.02 %，差异显著。同品种秋季花粉液氮保存前后萌发率变化趋势虽然与春季花粉相同，但差异显著性不一样。‘金凤凰’同春季花粉一样，液氮保存后萌发率显著下降，其他5个品种液氮保存前后萌发率没有显著变化。

2.4 6个月季品种花粉形态特征

为探讨花粉形态与超低温保存效果的关系，对6个品种花粉形态进行了电镜观察，结果见表4和图1。6个品种花粉共同之处，均以单粒形式存在，花粉粒大小中等，极面观为三裂圆形。有3条梭形萌发沟，沿极轴方向等间距环状分布，长度几乎达到两极。花粉粒大小、形状、萌发沟大小、孔穴直径等存在差异。

花粉形状为长球形和超长球形两类，极轴长与赤道轴长比值最大的为‘伦特娜’，最小的为‘金凤凰’；极轴最长的是‘金凤凰’，最短的是‘雨果’。‘伦特娜’花粉萌发沟最长，‘希望’最短；‘雨果’花粉沟宽最宽，‘伦特娜’最窄。6种月季花粉外壁均具有条脊，外壁纹饰以条纹状纹饰为主，覆盖层穿孔型，但条纹粗细、间距、走向有所不同，‘雨果’条脊最宽，‘金玛丽’最窄。‘金凤凰’花粉的条脊距最大，达到0.35 μm，其余品种之间无显著差异。4个品种孔穴直径为0.26 μm，而‘雨果’最大，‘希望’最小。

表4 6个月季品种花粉形态特征Table 4 The morphological characteristics of pollen grains of 6 rose cultivars

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：Different letters within same column indicate significant difference atP<0.05.

结合花粉液氮保存前后萌发率测定结果，可以看到‘金凤凰’和‘希望’为长球形(极轴长与赤道轴长之比小于2)，超低温保存后花粉活力呈下降趋势；而‘金玛丽’、‘雨果’、‘伦特娜’和‘仙境’为超长球形，超低温保存后萌发率基本保持稳定或稍有升高(‘金玛丽’)。从外壁纹饰分析，条脊宽度最窄、条脊间距最小的‘金凤凰’液氮保存后生活力下降明显，但与相似的‘伦特娜’液氮保存后生活力却很平稳，没有显示出与超低温保存效果的相关性。液氮保存效果不同的品种，具有相同或近似的萌发沟和孔穴数值，显示与超低温保存效果也不相关。

3 讨 论

有研究发现，现代月季品种花粉萌发的最适蔗糖浓度普遍高于野生种[13]。适于大多数蔷薇属植物花粉萌发的蔗糖浓度为5 %～8 %，超过15 %反而会抑制花粉萌发和花粉管的伸长[12]；但是也有研究表明，蔗糖浓度为15 %～20 %时最适合丰花月季花粉萌发[14]。本研究结果显示，6个现代月季品种花粉最适宜的蔗糖浓度为15 %，与之基本一致。适宜浓度的硼酸有利于花粉萌发管的生长，过高则会降低环境水势而对花粉萌发不利[15]，本研究中0.05 %硼酸较利于6个月季品种花粉萌发。

1 ‘金凤凰’、2‘金玛丽’、3‘伦特娜’、4‘仙境’、5‘希望’、6‘雨果’。A. 花粉赤道面观(×5000)；B. 花粉纹饰(×10000或×20000)；C. 花粉极面观(×5000)1 ‘Golden Scepter’,2 ‘Goldmarie’,3 ‘Len Turner’,4 ‘Carefree Wonder’,5 ‘Kiboh’,6 ‘Victor Hugo’).A. Pollen Equatorial view(×5000)；B. Pollen exine ornamentation(×10000 or×20000)；C. Pollen polar view(×5000)图1 6个月季品种的花粉形态Fig.1 Pollen morphology of 6 rose cultivars

超低温保存技术已经应用于多种园林植物花粉的长期储存，但保存效果存在差异[16-17]。在本研究中，6个品种花粉液氮保存后，生活力也同样呈现平稳、升高和降低3种情况，这种变化主要由品种决定，也受花粉采收季节影响。依据液氮保存结果，6个月季品种可分为三类：一类为‘仙境’、‘伦特娜’、‘雨果’，春、秋两季花粉液氮保存后与新鲜花粉萌发率均无显著差异；第二类为‘金玛丽’，液氮保存后萌发率呈上升趋势，春季花粉变化差异达到显著水平，而秋季未达到显著水平；第三类为‘金凤凰’和‘希望’，液氮保存后萌发率呈下降趋势，只是秋季采收的‘希望’花粉液氮保存前后差异未达到显著水平。超低温保存后花粉生活力的3种变化趋势在其他花粉超低温保存中也有类似报道[18-19]。原因尚待进一步研究。

已有大量研究显示，花粉含水量与液氮保存效果密切相关，本研究中花粉含水量与液氮保存前后花粉萌发率都未显著相关。主要是由于大多数植物的花粉在散粉时已处于部分脱水状态，一般认为含水量低于20 %的花粉可实现超低温保存[20-21]。本研究中，春、秋两季采收的月季花粉含水量均在9 %～12 %范围内，6个品种花粉均实现了超低温保存，支持该结论。

6个品种新鲜花粉含水量与萌发率未显著相关。春、秋季花粉含水量基本相似，即便有显著差异，差值也不大，但是春季花粉萌发率普遍显著高于秋季，表明自然散粉阶段的花粉，含水量已达到适宜范围，不成为影响花粉液氮保存前后萌发率的主要因子。春、秋季花粉液氮保存后生活力变化的差异，即春季花粉与其对照的新鲜花粉变化差异显著而秋季花粉不显著，与春季新鲜花粉具有较高的萌发率有关。

秋季花粉超低温保存后花粉萌发率较其对照的新鲜花粉变化较小，这可能与秋季温度较低，花粉具有一定的低温适应有关。有研究表明，某些物种的花粉在经过低温预冷冻之后，可以增加其超低温保存后的萌发率。时婷婷等研究结果表明预冷处理能够提高百合花粉超低温保存后的萌发率，其中以-20℃的预处理效果最好[22]。李广清对山茶花粉超低温保存研究中，预冷冻后的花粉超低温保存后较未经处理花粉萌发率偏高[10]。在本研究中，春秋季气温的差异可能与预冷冻的作用相似。

有研究表明较为原始的被子植物花粉体积比较大，花粉大小演变过程是从大到小进化的[23]。根据Walker花粉外壁纹饰演化趋势理论，花粉进化表现为由无结构层(表面光滑)到穿孔、粗糙、条纹状发展。花粉外壁的条纹是由分枝粗短、排列不整齐向分枝长且排列整齐演化，并且条脊由宽向窄进化[24]。供试的6个现代月季品种在极轴长、赤道轴长、外壁纹饰、萌发沟、孔穴直径间存在一定的差异。花粉液氮保存前后萌发率测定结果表明，长球形的‘金凤凰’和‘希望’，超低温保存后花粉活力有所下降；而超长球形的‘金玛丽’、‘雨果’、‘伦特娜’和‘仙境’，超低温保存后萌发率基本保持稳定。这可能与花粉越长、其体积与表面积之比就越小、调节功能越强这个理论有关[25]。

4 结 论

综上所述，6个月季品种春、秋季采收的室内自然散粉花粉，均实现了超低温保存。依品种和花粉采收季节不同，超低温保存后花粉生活力呈现不变、升高或降低3种变化。此外，超低温保存后花粉生活力变化还与花粉形状、新鲜花粉萌发率有关。虽然秋季采收的花粉超低温保存后萌发率较新鲜花粉变化较小，但6个品种春季采收的花粉萌发率均高于或等于秋季花粉，液氮保存后也有更高的萌发率，因此，更适宜进行超低温保存。春、秋季花粉含水量相似，但萌发率明显不同，液氮保存后生活力变化幅度也不同，其中原因值得进一步研究。