中华沙鳅繁殖过程中卵巢组织学特征和血液生化指标变化规律

周 剑，李 强，柯红雨，刘 超，苏旭涛，肖 宇，孙甲华，王新宇，张 露

(四川省农业科学院水产研究所，四川 成都 611731)

【研究意义】中华沙鳅(Sinibotiasuperciliaris)主要分布于长江中上游水系，肉质细嫩、味道鲜美，营养价值和药用价值兼备；其体态纤细，色彩艳丽，在观赏鱼市场也有良好的前景[1]。近年来，中华沙鳅由于过度捕捞，加之修建水利工程等对其自然繁殖环境的破坏，使其野生资源逐步减少，单价逐年上涨。【前人研究进展】目前，对中华沙鳅的研究主要集中在中华沙鳅的资源现状[2]、人工驯养和繁殖技术[3]、繁殖生物学[4-5]、消化系统结和功能[6]、胚胎发育[7]、年龄与生长[8]、食性[9]、营养成分[10]、疾病防治[11]、微卫星[12-13]、线粒体[14]以及遗传多样性[15]等多个方面。动物繁殖性能相关的研究一直备受关注，有研究发现动物的繁殖性能与血液生化指标存在较强的相关性，总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)等指标与鸭的繁殖性能均存在一定相关性[16-17]，而CHOL、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)等指标在鹤不同繁殖期也存在较大差异[18]。繁殖过程中鱼类会通过血液生理生化指标的改变来适应生理需要，已有的研究表明TP、ALB、GLO和血糖(GLU)等指标与性腺发育存在密切关系，血液生化指标的测定对于鱼类性腺发育时期的判定和提高人工繁殖技术都具有重要意义[19-20]。关于鱼类性腺发育的研究历来受到重视，了解鱼类性腺发育规律及其特点是鱼类繁殖生理学中最为基础的工作内容。中华沙鳅繁殖过程中卵巢组织学变化特征和血液生化指标变化规律的研究尚未见详细报道。【本研究切入点】本文通过对中华沙鳅繁殖过程中卵巢组织学特征和血液生化指标变化规律进行探讨。【拟解决的关键问题】旨在为中华沙鳅繁殖过程中卵母细胞变化规律、不同时期的卵径和血液生化指标提供参考数据，为进一步探究中华沙鳅繁殖过程中的卵巢发育特点、提高中华沙鳅繁殖力和了解其繁殖期健康状况提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

按照中华沙鳅的产卵特点将其整个繁殖过程分为繁殖前期(3-4月)、繁殖期(5-7月)、繁殖后期(8-9月)3个时期，分别于3、6、8月中旬采集不同时期雌性中华沙鳅血液样本和不同时期完整卵巢组织各5例，组织样本用4 %多聚甲醛固定备用，采用断尾采血法收集血液样本，置于1.5 mL离心管中，经静置后采用3000 r/min离心15 min，分离血清后，-80 ℃保存待测。试验所用中华沙鳅个体均为四川省农业科学院水产研究所人工培育达到性成熟的3龄中华沙鳅雌性个体，所用中华沙鳅体重范围为(13±3) g，体长范围为(11±3) cm。

1.2 组织切片制作和图像采集

固定后的卵巢组织经脱水，石蜡包埋后，制成5～7 μm厚的切片，苏木精-伊红(HE)染色后，中性树胶封片。采用数码三目摄像显微摄像系统(BA200Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)分别采集100和400倍放大切片图片，每张切片随机选取10个视野，观测每个视野中所有卵母细胞。

1.3 血液生化指标检测

本次实验共检测了9项血液生化指标，分别为丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHOL)等血液生化指标，以上指标均采用全自动生化分析仪(TC6010L，江西特康科技有限公司)进行测定，酶类采用速率法，其他为终点法[20]。

1.4 数据分析

组织切片采用 Image Pro Plus 5.1(MediaCybernetics, Bethesda, MD, USA)图像分析软件对各时相的卵母细胞进行观测。参考前人研究方法，根据中华沙鳅卵巢的组织学特征，将卵母细胞分为6个时相[21]。用JMP10.0.2(SAS Institute Inc. Cary, NC)软件对不同时期的血液生化指标检测数据进行分析，结果采用最小二乘均值±标准误(χ±Sχ)表示，采用Student’ t法进行检验，取P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 中华沙鳅繁殖前期卵巢组织学特征

繁殖前期卵母细胞呈小叶状分布，卵母细胞间有毛细血管和结缔组织构成的间质，以第Ⅱ时相卵母细胞为主，可见少量第Ⅲ时相卵母细胞(图1A)。第Ⅱ时相卵母细胞直径约50～110 μm，胞核直径约11～30 μm，胞体较小，细胞呈圆形或椭圆形，细胞质呈嗜碱性反应，染色后呈深蓝色，胞核明显，分布在细胞中央，核仁多个，多靠近核膜内侧分布；第Ⅲ时相卵母细胞直径约110～260 μm，胞核平均直径约70～105 μm，胞体较大，属于初级卵母细胞的大生长期，细胞质为弱嗜碱性，染色后呈粉色，胞质内靠胞膜边缘有空泡状小泡，胞核明显，多数第Ⅲ时相细胞胞核位于细胞中央(图1B)。

A：繁殖前期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞，HE，×100；B：繁殖前期卵巢，示细胞核(N)、核仁(Nu)、放射带(ZR)、滤泡细胞(FC)，HE，×400；C：繁殖期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ时相卵母细胞、授精孔(FH)，HE，×100；D：繁殖期卵巢，示第Ⅳ时相卵母细胞卵黄颗粒(YG)、放射带(ZR)，HE，×400；E：繁殖后期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ时相卵母细胞，HE，×100；F：繁殖后期卵巢，HE，×400A: Ovarian tissue in pre-spawning stage, showing the phase Ⅱand Ⅲ oocytes, HE. ×100; B: Ovarian tissue in pre-spawning stage, showing the cell nucleus (N), nucleolus (Nu), zona radiata (ZR), follicular cell (FC), HE. ×400; C: Ovarian tissue in spawning stage, showing the phaseⅡ, Ⅲ, Ⅳ, and Ⅴoocytes, fertilization hole (FH), HE. ×100; D: Ovarian tissue in spawning stage, showing the yolk granules (YG) and zona radiata (ZR) of phase Ⅳ oocytes, HE. ×400; E: Ovarian tissue in post-spawning stage, showing the phase Ⅱ, Ⅲ and Ⅵ oocytes, HE. ×100; F: Ovarian tissue in post-spawning stage, HE. ×400图1 中华沙鳅卵巢组织切片Fig.1 Observation of ovarical histological structure for Sinibotia superciliaris in three breeding stages

2.2 中华沙鳅繁殖期卵巢组织学特征

繁殖期以第Ⅳ时相卵母细胞为主，可见少数第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ时相卵母细胞(图1C)。第Ⅳ时相卵母细胞为初级卵母细胞大生长期的后阶段，即生长成熟阶段。细胞体积明显增大，第Ⅳ时相卵母细胞直径约570～720 μm。第Ⅳ时相卵母细胞细胞质中卵黄不断积累由细胞的边缘逐渐向中央扩展，最终充满整个细胞，而且卵黄颗粒不仅数量增加，体积也不断增大，随着卵母细胞的成熟，构成滤泡膜的两层滤泡细胞更加明显，并且内层滤泡细胞变得比外层滤泡细胞圆而大，放射膜增厚(图1C、D)。 第Ⅴ时相卵母细胞胞质内充满粗大的卵黄颗粒，体积明显增大，卵母细胞直径约700～950 μm。第Ⅴ时相卵母细胞中卵黄颗粒已充满整个卵母细胞并融合成板块状，核膜、核仁均消失，核质与动物极胞质融合。

2.3 中华沙鳅繁殖后期卵巢组织学特征

繁殖后期卵巢中以第Ⅱ时相卵母细胞为主，可见少量的第Ⅲ时相和第Ⅵ时相卵母细胞，核周细胞质内出现空泡(图1E)。第Ⅵ时相卵母细胞细胞形状不规则，体积变小，滤泡细胞增多、肥大，卵黄溃散、液化，放射膜模糊不清，细胞核消失或处于消失过程中，核膜崩解，卵膜变形、破裂，卵母细胞发生明显变形萎缩(图1F)。

2.4 繁殖过程中血液生化指标变化规律

中华沙鳅繁殖过程中CHOL、TG、ALB等血液生化指标呈先上升后降低趋势，ALP则呈现出先降低后上升的变化趋势，ALT、GLU、TP、GLO等血液生化指标呈逐渐上升趋势， 而AST则呈逐渐下降的变化趋势，中华沙鳅繁殖过程中所检测的各项血液生化指标虽然都有所变化，但均未呈现出显著差异，各项血液生化指标测定结果见表1。

3 讨 论

3.1 中华沙鳅繁殖过程中卵巢组织学特征

关于鱼类性腺发育分期方法众多，许多学者在前苏联学者B.A.Meйeн(1939)分期方法的基础上不断加以改进和完善，根据卵母细胞的细胞学特征，将其生长发育过程分为 6 个时相，其方法、内容和名称日趋一致[21]。因此，本文参考前人研究方法，将中华沙鳅的卵细胞的形成分为 6 个时相，即卵原细胞期、单层滤泡期、卵黄泡期、卵黄充满期、成熟期和退化期。本试验发现中华沙鳅繁殖前期其卵巢内卵母细胞以第Ⅱ时相卵母细胞为主，可见少量第Ⅲ时相卵母细胞；繁殖期以第Ⅳ时相卵母细胞为主，可见少数第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ时相卵母细胞；繁殖后期卵巢中以第Ⅱ时相和第Ⅲ时相卵母细胞为主，可见少量第Ⅵ时相卵母细胞。在繁殖过程中，中华沙鳅卵母细胞从第Ⅱ时相生长发育到第Ⅴ时相基本上是同步的，繁殖后期的卵巢以第Ⅱ时相卵母细胞为主，可见排卵后留下来的滤泡膜和结缔组织，有少量未产出的卵母细胞退化后形成的第Ⅵ时相卵母细胞，没有或很少有次发性的Ⅲ时相和Ⅳ时相卵母细胞，符合一次性产卵鱼类特征，试验结果与杨明生等所推测的中华沙鳅为一次性产卵鱼类的观点一致[22]。

表1 中华沙鳅繁殖过程中不同时期血液生化指标(最小二乘均值±标准误)Table 1 Blood biochemical indices of Sinibotia superciliaris in different stages during the breeding process (χ±Sχ)

已有研究发现卵径大小能够直接影响孵化后鱼苗的生长和存活率[23]，因此对鱼类繁殖过程中卵径进行测定和分析具有重要的意义。本试验检测结果显示中华沙鳅繁殖前期卵母细胞体积逐渐变大，大部分卵母细胞开始由小生长期向营养物质储备的大生长期过渡，发育至繁殖期大部分的卵母细胞中卵黄颗粒大量沉积，卵母细胞体积显著增大，而繁殖后期卵巢中未能顺利排卵的卵母细胞会退化并被吸收，逐渐出现变形萎缩。中华沙鳅繁殖过程中卵母细胞变化特征与大多数鱼类相似，但不同鱼类各时相卵母细胞的大小均有所不同。杨明生等[22]曾在体视显微镜下对性腺发育至 Ⅳ期收集自金沙江流域中华沙鳅卵巢中的1000粒卵的卵径进行测定，所测定卵径范围在200～1400 μm。而本试验检测结果显示中华沙鳅繁殖过程中卵径范围在50～950 μm，卵径略小于金沙江流域采集的中华沙鳅卵径，可能是由于实验采用中华沙鳅的个体大小、生长环境、养殖方式和性腺发育程度不同等多种原因导致。在鳅科鱼类中，大鳞副泥鳅第Ⅲ、Ⅵ时相卵母细胞直径范围在191～870 μm[24]，长薄鳅第Ⅲ时相到第Ⅴ时相卵母细胞直径范围在235～1185 μm[25]，比较发现中华沙鳅卵母细胞直径小于同为鳅科鱼类的大鳞副泥鳅和长薄鳅。通过对中华沙鳅繁殖过程中卵巢组织学特征的研究，为其不同时期卵巢发育特点和卵母细胞卵径大小提供了参考数据

3.2 繁殖过程中血液生化指标变化规律

鱼类血液生化指标不仅能反映鱼类的物种特征及生理状态，还能为繁殖和病理研究等提供重要参考依据[26]。在繁殖过程中，鱼类会通过血液生理生化指标的改变以适应繁殖期间的生理需要，血液生化指标对反映动物生理功能正常与否具有重要的指示作用[19]。肝脏是机体代谢和能量产生的重要场所，繁殖期间内分泌机能的改变和对能量需求的增加，肝脏功能异常很可能影响鱼类卵巢的成熟及排卵活动[27]。肝脏是TP、ALB和GLO合成的主要场所，ALT和AST是目前肝功能检查常用的重要血清酶学指标，这些血液生化指标的变化可以从一定程度上反应肝脏的代谢能力[28]，可有效地了解繁殖过程中中华沙鳅的健康状况。此外，血液生化指标的测定还可用于鱼类性腺发育时期的判定，研究表明用ALB/GLO、TP和钙离子(Ca2+)水平来判断施氏鲟卵巢发育阶段的判别准确率可达100 %[29]，而用血液淀粉酶(AMS)、Ca2+、肌酐(CR)和GLU来判断西伯利亚鲟雌鱼性腺发育时期的判别准确率也可达100%[20]。

鱼类血浆中各类蛋白含量与性腺发育过程相关，与卵黄蛋白原的含量存在线性关系[30]，已有研究发现ALB水平在西伯利亚鲟性腺发育和鲻鱼繁殖过程中均呈现出先升高后降低的变化趋势，在产卵前ALB水平达到最高，产卵后ALB水平逐渐下降[20, 31]，本试验中华沙鳅繁殖过程中ALB也同样呈现出了先上升后降低趋势。在施氏鲟卵巢发育过程中AST/ALT呈显著下降趋势，GLU呈先上升后降低趋势，而ALB和CHOL则呈逐渐上升趋势[29]，本试验中华沙鳅繁殖过程中AST/ALT也呈现出了逐渐下降趋势的变化趋势，而中华沙鳅繁殖过程中GLU呈逐渐上升趋势，ALB和CHOL呈先上升后降低趋势，这与施氏鲟存在一定差异。在中华沙鳅繁殖过程中所检测的血液生化指标虽未呈现出显著差异，但仍出现了一定变化，可能是由于繁殖期间内分泌机能的改变和对能量需求的增加，肝脏的代谢效率也会发生相应的变化，导致ALT和AST等指标也会随之发生变化。此外，鱼类在繁殖过程中卵巢发育所消耗的营养物质主要为脂类物质[32]，随着卵巢发育对能量需求的增加，机体会将更多的营养物质不断转化为能量以维持自身正常的生理活动，从而导致TP、GLU、CHOL等水平也不断发生改变。然而鱼类血液生化指标不仅受年龄、性别、繁殖和食性等内源性因素影响，还会受到饵料、溶氧、温度、养殖方式和疾病等环境因子影响[19]，不同种属鱼类繁殖过程中的代谢存在较大差异，血液生化指标变化规律也存在一定差异，中华沙鳅繁殖过程中生化代谢机理还有待进一步研究。

4 结 论

本文对中华沙鳅繁殖前期、繁殖期和繁殖后期卵巢组织学特征和血液生化指标变化规律进行了研究，对中华沙鳅繁殖过程中不同时期卵巢内卵母细胞组成和发育变化规律进行了探讨，测定了不同时相的卵母细胞直径，并对不同时期的ALT、AST、ALP、CHOL、TG、GLU、TP、ALB、GLO等血液生化指标变化规律进行了总结，该结果为中华沙鳅繁殖过程中卵母细胞变化规律、不同时期的卵径和血液生化指标提供参考数据，为进一步探究中华沙鳅繁殖过程中的卵巢发育特点、提高中华沙鳅繁殖力和了解其繁殖期健康状况提供理论依据。