植物皂素提取液对枯草芽孢杆菌发酵表达蛋白酶与果胶酶的影响

陈钰泉 刘玉婷 仇敏

摘要：通过在植物皂素液中添加不同浓度植物（川芎、旱莲草、香附、白芷、当归、黄芪）提取混合液及葡萄糖，测定植物皂素发酵液中枯草芽孢杆菌共表达蛋白酶、果胶酶活性。直接发酵时，发酵液中蛋白酶、果胶酶活性分别在发酵32、24 h时达到最大值，分别为3 984、227 U/ml;添加5%混合植物提取液后，发酵液中蛋白酶活性下降了37.55%，果胶酶活性提高了3.83倍;当皂素提取液中的植物提取液添加量提高至10%后，发酵液中蛋白酶活性最大值下降了66.59%;果胶酶活性最大值提高了4.94倍。当以添加5%葡萄糖的皂素提取液作为发酵基质进行发酵时，发酵液中蛋白酶、果胶酶活性分别在发酵40、8 h时达到最大值，分别为2 451、1 390 U/mL;当在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加5%混合植物提取液后，发酵液中蛋白酶活性最大值降低 61.32%，果胶酶活性最大值提高5.54%;当在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加10%混合植物提取液后，发酵液中蛋白酶活性最大值降低33.37%，果胶酶活性最大值提高30.65%。当直接在皂素提取液中添加植物提取液而不添加葡萄糖时，植物提取液添加量的提高对果胶酶活性有促进作用，对蛋白酶活性有抑制作用;当在皂素提取液中添加5%葡萄糖時，植物提取液添加量的提高同样利于果胶酶活性的提高。

关键词：果胶酶;蛋白酶;皂素;发酵;枯草芽孢杆菌

中图分类号：S188+.4   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）11-0322-05

植物来源的皂苷包括三萜皂苷和甾体皂苷，因其水溶液振摇后可产生持久性似肥皂溶液的泡沫而得名[1]。在自然界中，三萜皂苷主要分布于无患子科、豆科、茶科、菊科、五加科、桔梗科、远志科、伞形科、葫芦科等植物中;而甾体皂苷主要分布在百合科、薯蓣科、玄参科、姜科、豆科等植物中。无患子、茶饼和艾草中都含有丰富的三萜皂苷[1-4]，这类皂苷属于一种优良的非离子表面活性剂，具有较好的去污洗涤能力及体外抗菌杀虫、抗氧化活性，易于生物降解，在临床上主要被应用于各类杀虫止痒以及出血症、内科、妇科等疾病的治疗。

川芎为伞形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）的干燥根茎，始载于《神农本草经》，其性温，味辛、微苦，具有活血行气、祛风止痛的功效[5]，临床上常被用于治疗胸痹心痛、胸胁刺痛、跌扑肿痛、月经不调、头痛、风湿痹痛等疾病[6]。旱莲草（Herba ecliptae），别称墨旱莲[7]，为菊科鳢肠的干燥地上部分，具有促使毛发生长、降低血脂、止血、免疫调节等药理作用[8]。香附为莎草科植物莎草（Cyperus rotundus L.）的干燥根茎，具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效，临床上常被用于治疗肝郁气滞、胸胁胀痛、疝气疼痛、乳房胀痛、月经不调等疾病[9]。白芷（Angelica dahurica）[10]，为伞形科植物，具有发散风寒、通窍止痛、燥湿止带、消肿排脓等功效[11]。当归为伞形科植物当归[Angelia Sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效[12]，主要被用于月经不调、血虚头痛、肠燥便难、崩漏、跌扑损伤等疾病的治疗[13]。黄芪为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao]或膜荚黄芪[Astragalus membrana-ceus （Fisch.） Bge.]的干燥根，归脾肺二经，具有补中益气、健脾益肺、托毒生肌的功效[14-15]。

本试验通过在植物皂素液中添加川芎、旱莲草、香附、白芷、当归、黄芪等多种植物提取液，考查多种植物提取液对枯草芽孢杆菌发酵皂素提取液共表达蛋白酶、果胶酶活性的影响，以期为工业化发酵皂素提取液制备洗涤剂提供依据。

1 材料

1.1 试剂与仪器

福林酚、三氯乙酸、酪蛋白、果胶、牛血清白蛋白、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉、一水硫酸锰购于天津市大茂化学试剂厂。

TDZS-WS型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）;HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）;759S型紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）;G48661F型移液枪（德国艾本德股份公司）;BSA224S型分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司];YXQ-LS-50SII立式蒸汽压力灭菌柜（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试验菌株

枯草芽孢杆菌CICC23083购于商城北纳创联生物科技有限公司。

2 方法

2.1 多种植物提取液的制备

川芎提取液的提取方法参照文献[16]，旱莲草提取液的提取方法参照文献[17]，香附提取液的提取方法参照文献[18]，白芷提取液的提取方法参照文献[19]，当归提取液的提取方法参照文献[20]，黄芪提取液的提取方法参照文献[21]，将各提取液浓缩至1 g/mL，4 ℃保存备用。

2.2 发酵基质的准备

按照质量比分别为90%、5%、5%称取适量无患子、艾草、茶籽粕，在60 ℃条件下以1 g ∶ 18 mL的固液比在pH值为9的水溶液中提取3 h。经2 810 r/min离心10 min，取上清液，将川芎、旱莲草、白芷、黄芪、香附、当归提取液等体积混合后，在皂素提取液的上清液中分别添加5%、10%该混合植物提取液作为发酵基质，以不添加混合植物提取液的皂素提取液为直接发酵基质。

2.3 酶液的制备

向发酵基质中接种5%枯草芽孢杆菌菌液进行发酵，每 8 h 取发酵液在4 000 r/min下离心10 min，取上清液，为粗酶液。

2.4 蛋白酶活性测定

在1 mL酪蛋白（1%）底物中加入1 mL粗酶液，在 40 ℃、pH值为7的条件下反应10 min后加入2 mL三氯乙酸（0.4 mol/L）终止反应，用紫外分光光度计在680 nm处测定溶液的吸光度。以1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸需要的酶量为1个活性单位[22]。

2.5 果胶酶活性测定

在25 mL比色管中加入1 mL果胶溶液（1%），50 ℃预热10 min，加入2 mL pH值为5的缓冲溶液和1 mL粗酶液，在50 ℃条件下反应30 min，迅速加入4 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，在 100 ℃ 条件下水浴5 min，取出后迅速用流水冷却以终止显色反应，在540 nm处测定溶液吸光度。以 1 mL 酶液在50 ℃、pH值为5.0的条件下，1 min分解果胶产生1 μg D-半乳糖醛酸需要的酶量为1个酶活性单位[23]。

2.6 洗涤效果测定

以25%黄油、25%猪油、50%花生油配比，另加5%甘油酯配制人工污垢，称量涂抹人工污垢前后的干净培养皿底座的质量，用发酵液洗涤涂抹有人工污垢的培养皿底座后称质量，以评价发酵液的洗涤性能[24]。洗涤性能计算公式：

Y=（m1-m2）/（m1-m0）×100%。

式中：Y表示洗涤性能;m0表示涂抹人工污垢前培养皿底座的质量;m1表示涂抹人工污垢后培养皿底座的质量;m2表示用发酵液洗涤涂抹有人工污垢的培养皿底座后干净培养皿底座的质量。

3 结果与分析

3.1 枯草芽孢杆菌发酵皂素提取液共表达蛋白酶和果胶酶活性

从图1-A可以看出，以皂素提取液为发酵基质，接种枯草芽孢杆菌发酵24 h时，发酵液达到最大生物量，并在发酵24～48 h内维持相对稳定的生物量，表明植物皂素提取液富含可以满足枯草芽孢杆菌生长的营养物质。在发酵过程中，果胶酶活性随时间的变化趋势与生物量相似。在发酵24 h时，发酵液中果胶酶活性达到最大值，为227 U/mL，此后果胶酶活性开始下降，并在发酵32～48 h内保持稳定水平。然而，蛋白酶活性随时间的变化趋势与果胶酶不一样。蛋白酶活性在最初发酵的16 h内较小，在发酵16～32 h范围内迅速增大，且在发酵32 h时达到最大值，为3 984 U/mL。此后，蛋白酶活性开始下降，发酵40 h时，蛋白酶活性为 3 069 U/mL。因此，蛋白酶活性的峰值滞后于生物量及果胶酶活性。

在皂素提取液中添加5%混合植物提取液，接种枯草芽孢杆菌进行发酵，考察5%混合植物提取液对枯草芽孢杆菌发酵不添加葡萄糖的皂素液共表达蛋白酶、果胶酶活性的影响，结果见图1-B。

从图1-B可以看出，在发酵0～32 h内，发酵液的生物量随着时间的延长而增大，发酵32 h后，生物量开始逐渐降低。蛋白酶、果胶酶活性随着生物量的增长而增大。蛋白酶、果胶酶活性分别在发酵40、32 h时达到最大值，分别为 2 488、1 097 U/mL。蛋白酶活性的最大值比果胶酶延迟8 h。与直接发酵相比，添加5%混合植物提取液后，发酵液中蛋白酶活性的最大值下降了37.55%，果胶酶活性的最大值提高了3.83倍。

在皂素提取液中添加10%混合植物提取液，接种枯草芽孢杆菌进行发酵，考察10%混合植物提取液对枯草芽孢杆菌发酵不添加葡萄糖的皂素液共表达蛋白酶、果胶酶活性的影响，结果见图1-C。

由图1-C可知，在发酵0～32 h内，皂素发酵液的生物量随着时间的延长而增大;在发酵时间为32～48 h时，皂素发酵液的生物量略有下降。蛋白酶、果胶酶活性最初随着生物量的增大而提高，并在发酵24 h后达到最大值，分别为1 331、1 348 U/mL。与直接发酵相比，当皂素提取液中的植物提取液提高至10%后，发酵液中蛋白酶活性达到最大值的时间缩短了8 h，最大值下降了66.59%;果胶酶活性最大值提高了4.94倍。

3.2 枯草芽孢杆菌发酵添加5%葡萄糖的皂素提取液共表达蛋白酶、果胶酶活性

从图2-B可以看出，在皂素提取液中添加5%葡萄糖后，枯草芽孢杆菌生物量在发酵48 h后达到最大值。与不添加葡萄糖直接以皂素提取液进行发酵（图2-A）相比，添加5%葡萄糖后，发酵液中枯草芽孢杆菌的生物量峰值明显推迟了。发酵液中蛋白酶活性随时间的变化趋势与直接发酵皂素提取液类似。在发酵前16 h中，蛋白酶活性处于较低的水平，此后不断增加，并在发酵40 h时达到最大值，为 2 451 U/mL，比直接发酵降低了38.48%。表明在皂素提取液中添加5%葡萄糖可为枯草芽孢杆菌提供足够的能量物质来维持较长时间的繁殖。然而，果胶酶活性随时间的变化趋势与直接发酵皂素提取液不同。在添加5%葡萄糖后，果胶酶活性的最大值为1 390 U/mL，比直接发酵皂素提取液高 5.12倍。表明葡萄糖对果胶酶活性有较大的影响，这种可消

化的碳水化合物可作为枯草芽孢杆菌新陈代谢的主要能量来源，优先为枯草芽孢杆菌表达与分泌果胶酶提供能量和物质，最终导致蛋白酶的表达相对缺乏。

在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加5%混合植物提取液后，接种枯草芽孢杆菌进行发酵，结果如图2-C所示。

由图2-C可知，在发酵0～32 h内，皂素发酵液的生物量随着时间的延长而增大，并在发酵32 h时达到最大值。蛋白酶、果胶酶活性随着生物量的增大而提高，并在发酵32 h时达到最大值，分别为948、1 467 U/mL。表明与以添加5%葡萄糖的皂素提取液作为发酵基质相比，进一步添加5%混合植物提取液后，发酵液中果胶酶活性的最大值提高 5.54%，蛋白酶活性的最大值降低61.32%。

在添加5%葡萄糖的皂素提取液中添加10%混合植物提取液后，接种枯草芽孢杆菌进行发酵，结果如图2-D所示。

由图2-D可知，在发酵0～32 h内，皂素发酵液的生物量随着时间的延长而增大;在发酵时间为32～48 h时，皂素发酵液的生物量略有下降。果胶酶、蛋白酶活性在一定范围内随着生物量的增大而提高，并在发酵16 h时，果胶酶活性达到最大值，为1 816 U/mL;发酵32 h时，蛋白酶活性达到最大值，为1 633 U/mL。结果表明，与以添加5%葡萄糖的皂素提取液作为发酵基质相比，进一步添加10%混合植物提取液后，发酵液中蛋白酶活性最大值降低33.37%，果胶酶活性最大值提高30.65%。

3.3 洗涤效果

由图3可知，直接以皂素提取液为发酵基质，用枯草芽孢杆菌进行发酵16 h后，皂素发酵液的洗涤效果没有明显增加，这可能与果胶酶活性较低（≤170 U/mL）和蛋白酶活性很低有关。然而，在发酵24 h时，发酵液中蛋白酶活性急剧增大，达到3 446 U/mL，果胶酶活性达到最大值（227 U/mL），此时，皂素发酵液的洗涤效果得到明显提高。与发酵前皂素提取液的洗涤效果相比，经枯草芽孢杆菌发酵32 h后的皂素提取液洗涤效果提升了8.18百分点，此时，蛋白酶活性达到最大值，为3 984 U/mL，同时果胶酶表现出相对较高的活性。

在皂素提取液中添加5%葡萄糖后，以枯草芽孢杆菌进行发酵，结合图3与图2-B可以看出，发酵8 h后发酵液中果胶酶活性达到最大值（1 390 U/mL）， 发酵液中的蛋白酶活

性在发酵24 h后也明显增大（1 004 U/mL）。然而，当发酵至32 h时，果胶酶活性开始明显减小（1 146 U/mL），同时洗涤效果也开始明显下降。从这些结果可以推论出，提高蛋白酶、果胶酶活性可以在一定程度上提高皂素提取液的洗涤效果。同时提示，将蛋白酶和果胶酶应用于纯植物皂素洗涤剂中可以避免化学洗涤剂带来的环境污染问题。

从图3可以看出，无论是直接以皂素提取液为发酵基质，还是以添加5%葡萄糖的皂素提取液作为发酵培养液，经枯草芽孢杆菌发酵后，发酵液中的皂素浓度都没有明显变化。表明枯草芽孢杆菌和发酵条件对皂素提取液中的皂素浓度没有明显影响。

4 结论

多种植物皂素提取液中富含果胶，这些果胶与溶液中的蛋白类物质结合后容易发生絮凝沉淀，从而导致皂素提取液性能极不稳定。因此，本研究以共表达蛋白酶和果胶酶的枯草芽孢杆菌CICC23083为发酵菌株，对多种植物皂素提取液进行发酵，考察川芎、旱莲草、香附、白芷、当归、黄芪等多种植物提取液对枯草芽孢杆菌发酵产酶的影响。结果表明，当直接在皂素提取液中添加植物提取液而不添加葡萄糖时，植物提取液添加量的提高对蛋白酶活性有抑制作用，对果胶酶活性有促进作用，这可能表明，蛋白酶作为枯草芽孢杆菌的内源性酶，当培养液中富含足够供枯草芽孢杆菌生长繁殖的营养物质时，枯草芽孢杆菌优先利用这些营养物质合成自身生长繁殖需要的菌体蛋白，导致枯草芽孢杆菌优先分泌果胶酶，而不是内源性蛋白酶;当在皂素提取液中添加5%葡萄糖时，植物提取液添加量的提高不利于蛋白酶活性的提高，同时利于果胶酶活性的提高。

本研究明確了枯草芽孢杆菌对添加不同量混合植物提取液的皂素提取液发酵效果，为以混合植物为原料的生物发酵技术和纯中药发酵产品开发奠定了理论基础。

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