补骨脂二氢黄酮甲醚在大鼠体内的组织分布

郭晓伟， 钱 珺， 郭夫江， 谢 凡， 李医明， 王 瑞， 李文艳∗

（1.上海中医药大学附属曙光医院心血管内科，上海200120；2. 上海市浦东新区公利医院药剂科，上海200135；3.上海中医药大学中药学院，上海201203）

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，其性温，味辛、苦，归肾、脾经，具有温肾助阳、 纳气平喘、 温脾止泻的功效［1］，补骨脂二氢黄酮甲醚是从中提取分离得到的天然产物，具有广泛的生物活性，如抗癌、抗血管生成、抗过敏、抗炎、抗菌、抗氧化、治疗阿兹海默症等［2-8］，课题组前期研究发现［9-10］该成分是天然的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR） 三重激动剂，有明显的抗糖尿病、血脂异常特性，而且可改善小鼠脂肪肝；药代动力学研究显示，它在大鼠体内的血药浓度较低，表观分布容积较大，可能存在广泛的组织分布［11］，但目前尚无有关其组织分布的报道。因此，本实验建立超高效液相串联质谱法（UPLC-MS／MS） 检测大鼠灌胃给药后主要器官中补骨脂二氢黄酮甲醚组织浓度，研究该成分组织分布，以期为其体内动态变化过程提供更多数据，合理解释其有效性和毒副作用，并为后续相关研究提供参考。

1 材料

1.1 试药 补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素（内标） 从补骨脂中分离纯化得到，其结构通过质谱、氢谱、碳谱鉴定，含有量＞98%。乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）； 甲酸为色谱纯 （德国CNW 公司）；甲醇等其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水（自制）。

1.2 仪器 UltiMate 3000 超高效液相色谱-TSQ 三重四级杆质谱联用系统，配置脱气装置、自动进样器、柱温箱、质谱检测器等（美国Thermo Fisher公司）；BT25S 电子分析天平 （德国Sartorius 公司）；冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；Vortex-5 漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；高通量组织研磨仪（上海万柏生物科技有限公司）。

1.3 动物 清洁级SD 大鼠，雄性，体质量（200±20） g，由上海中医药大学实验动物中心提供［购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK（沪）2012-0002］，相关动物实验符合上海中医药大学实验动物伦理委员会要求（批准文号ACSHU-20110G115）。

2 方法与结果

2.1 标准溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取补骨脂二氢黄酮甲醚约10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容，即得，4 ℃下保存。

2.1.2 内标溶液 精密称取补骨脂甲素约10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容，4 ℃下保存。临用前精密移取适量， 乙腈逐级稀释成1 μg／mL，即得。

2.2 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相0.05%甲酸-乙腈， 梯度洗脱， 程序见表1； 体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 质谱条件 ESI 离子源， 多反应监测（MRM），正离子模式。喷雾电压3 500 V；加热气温度300 ℃；鞘气30 arb（1 arb=175 kPa）；辅助气10 arb；离子传输毛细管温度251 ℃；扫描峰宽m／z 0.500；单峰扫描时间0.250 s，优化后质谱参数见表2。

表2 优化后各成分质谱参数Tab.2 MS parameters for various constituents after optimization

2.4 组织分布实验 36 只大鼠随机分为6 组（5组给药组，1 组空白组），每组6 只，给药前禁食12 h，自由饮水。精密称取补骨脂二氢黄酮甲醚适量，溶于聚乙二醇（PEG400）、聚乙二醇硬脂酸酯（HS15） 中，配制成30 mg／mL 淡黄色透明均一溶液，临用前生理盐水稀释至6 mg／mL，单次灌胃给 药， 剂 量 为70 mg／kg。 于 给 药 后0.083、0.25、0.5、1、4 h 麻醉，腹主动脉取血，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠，生理盐水洗去表面浮血，滤纸吸干残余液体，分装，-80 ℃冰箱中冻存备用。

2.5 样品前处理 分析前，将组织样品从-80 ℃冰箱中取出，室温下放置使其自然解冻。精密称取100 mg，加入3 倍量超纯水匀浆（90 s、64 Hz），精密移取50 μL，置于1.5 mL 离心管中，加入补骨脂甲素（内标，1 μg／mL） 5 μL，195 μL 乙腈沉淀蛋白，涡旋5 min，离心（4 ℃、13 000 r／min）10 min，上清液再次离心，置于液相小瓶中分析。2.6 数据处理 Xcalibur 2.2 软件（美国Thermo公司） 计算每只大鼠给药后不同时间点各组织中药物浓度。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性试验 取空白肝组织匀浆、加入补骨脂二氢黄酮甲醚（1 ng／mL） 后肝组织匀浆、给药4 h 后肝组织匀浆适量，按“2.5” 项下方法处理后在“2.2” 和“2.3” 项条件下进样测定，结果见图1～2。

图1 补骨脂二氢黄酮甲醚MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of bavachinin

图2 补骨脂甲素（内标） MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of bavachin（internal standard）

由图可知，样品预处理后内源性物质不干扰待测物、内标测定，方法专属性良好。

2.7.2 线性关系考察 精密移取内标溶液（1 μg／mL）5 μL、“2.1.1”项下对照品溶液5 μL、乙腈190 μL，加入50 μL 空白组织匀浆中，按“2.5” 项下方法处理，配制成含补骨脂二氢黄酮甲醚600、500、300、100、50、20、5、2、1、0.4 ng／mL 的标准样品溶液，在“2.2” 和“2.3” 项条件下进样测定。以待测物质量浓度为横坐标（X），待测物与内标峰面积比值为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，可知该成分在各组织中线性关系良好，最低定量限（LLOQ） 为0.4 ng／mL（信噪比S／N＞5）。

表3 补骨脂二氢黄酮甲醚在各组织中的线性关系Tab.3 Linear relationships of bavachinin in various tissues

2.7.3 精密度、准确度试验 取“2.7.2” 项下标准样品溶液（0.4 ng／mL） 及低、中、高质量浓度 （1、 50、 500 ng／mL） 质 控 样 品 溶 液， 按“2.5” 项下方法处理， 于24 h 内在 “2.2” 和“2.3” 项条件下进样测定5 次，连续3 d，结果见表4，可知该方法精密度、准确度良好。

表4 精密度、准确度试验结果（n=6）Tab.4 Results of accuracy and precision tests（n=6）

2.7.4 提取回收率、基质效应试验 取“2.7.2”项下标准样品溶液及“2.7.3” 项下质控样品溶液，平行6 份，在“2.2” 和“2.3” 项条件下进样测定，比较提取后的峰面积与空白匀浆提取后加入补骨脂二氢黄酮甲醚的峰面积，考察提取回收率； 比较向提取后空白组织匀浆液中加入“2.1.1” 项下对照品溶液所得峰面积与相同质量浓度对照品溶液所得峰面积，考察基质效应，结果见表5，可知均符合FDA 生物样品分析指南［12］规定。

表5 提取回收率、基质效应试验结果（n=6）Tab.5 Results of extraction recovery and matrix effect tests（n=6）

2.7.5 稳定性试验 空白肝脏匀浆中加入补骨脂二氢黄酮甲醚，制备标准样品、质控样品溶液，平行6 份，室温下放置24 h（短期稳定性），-80 ℃下放置2 周（长期稳定性），反复冻融3 次（冻融稳定性），自动进样器中放置8 h（自动进样器稳定性） 后，在“2.2” 和“2.3” 项条件下进样测定，结果见表6，可知待测物在组织样品中稳定。

表6 稳定性试验结果（n=6）Tab.6 Results of stability tests（n=6）

2.8 组织浓度测定 将灌胃后0.083、0.25、0.5、1、4 h 分离的各组织制成匀浆，按“2.5”项下方法处理，测定组织浓度，公式为组织浓度=样品溶液质量浓度×稀释倍数 （5 倍） ×0.3 mL／组织质量，结果见表7、图3。灌胃给药后各组织中均可检测到补骨脂二氢黄酮甲醚，其组织浓度依次为胃＞小肠＞肝＞肺＞肾＞脾＞心＞脑，而且除胃、小肠（0.25 h） 外其他组织在0.5 h达到最高浓度。

表7 补骨脂二氢黄酮甲醚组织浓度测定结果（n=6）Tab.7 Results of tissue concentration determination of bavachinin（n=6）

图3 不同时间点各组织中补骨脂二氢黄酮甲醚组织浓度Fig.3 Tissue concentrations of bavachinin in various tissues at different time points

3 讨论

生物样品通常样品量少，药物浓度低，并含有大量内源性杂质。本实验建立UPLC-MS／MS 法，并选择MRM 模式，具有较高的精密度与分辨率，并可有效避免其他内源性杂质对待测物的干扰［13］，而且该方法灵敏、稳定、可靠，分析时间短，可用于生物样品中低浓度补骨脂二氢黄酮甲醚的检测。

本实验发现，补骨脂二氢黄酮甲醚在心、肝、脾、肺、肾、脑中的分布较迅速，5 min 后即可检测到该成分，15 min 后达到较高浓度，达峰时间约为30 min，1 h 后其组织浓度明显降低，4 h 后基本消除，这与课题组前期药动学研究结果一致；脑中也有补骨脂二氢黄酮甲醚，表明该成分可通过血脑屏障；肝中补骨脂二氢黄酮甲醚组织浓度较高，表明该成分可能在肝脏富集，从而发挥缓解脂肪肝的作用。胃和小肠是药物主要吸收器官，由于补骨脂二氢黄酮甲醚呈弱酸性和脂溶性，故在胃酸环境中主要呈非离子型，易在胃肠中被动扩散吸收［14］，本实验发现给药1 h 后小肠中该成分组织浓度再次升高，可能与重吸收有关。