桂花OfAP1基因的克隆及表达分析

蒋琦妮，付建新，张 超，董 彬，赵宏波

（浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300）

高等植物成花受到自身遗传因素和外界环境因素的共同影响［1-2］。当植物完成成花诱导，花器官原基开始分化，逐渐形成花萼、花瓣、雄蕊和心皮等组织。在这期间，植物的茎尖分生组织形态发生了很大的变化，同时成花素FT（FLOWERING LOCUS T）的表达量显著增加并参与调控花芽分化［3］。在模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana以及许多物种中已经证实，FT可以通过激活花芽分化组织特异性基因AP1（APETALA1）的表达促使植物完成开花进程［4］。过表达AP1基因，不论在长、短日照下拟南芥都会出现早花表型［5］，其突变体ap1则出现明显的晚花表型［6］。在茎尖分生组织，AP1基因不仅在植物成花诱导的调控网络中起核心作用，而且也决定花器官的形成。AP1基因是植物ABCDE分化模型中的A类基因，控制第一轮花萼和第二轮花被片组织的形成［7］，同时AP1也调控SEP3（SEPALLATA3）与LFY（LEAFY）基因的表达，促进花萼和花瓣的分化［8-9］。另外在拟南芥ap1突变体研究中发现，AP1突变会引起花器官的异常发育，如花萼发育成叶片、花瓣缺失等［10-11］。人们已从多种观赏植物中分离得到了AP1基因，并且对多个物种的AP1基因进行了功能验证和分析。超表达AP1及其同源基因都能促进开花，在拟南芥中异源表达百合Lilium longiflorum，蝴蝶兰Phalaenopsis aphrodite以及山茶Camellia japonica的AP1同源基因都能引起早花现象［12-14］。同时，在拟南芥AP1突变体中异源表达百合，枇杷Eriobotrya japonica以及麻疯树Jatropha curcas中的AP1基因，都可以回补其突变体花器官缺陷的性状［12，15-16］。桂花Osmanthus fragrans是中国十大传统名花之一，也是常见的园林绿化树种。按照开花习性不同，可分为秋桂和四季桂，秋桂仅在每年秋季开花，花序常为无总梗的聚伞花序［17］；关于其成花过程以及花芽分化和发育报道较少。木本植物桂花成花的机制与草本植物拟南芥等有一定差异。为深入了解桂花的成花机制，有必要分离成花相关基因并展开相关研究。本研究以秋桂品种 ‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’为材料，克隆桂花AP1基因（OfAP1），并对其序列进行生物信息学分析，同时运用荧光定量对其组织和时空表达进行分析，以明确OfAP1基因的基本特征和表达模式，为今后桂花的开花分子机理研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以盆栽 ‘堰虹桂’为材料，选取相同株龄且生长一致的植株。取桂花不同组织的样品，包括根、茎、叶、叶芽、花芽、盛开期的花朵；同时根据桂花花芽分化进程取叶芽、花序分化期、花萼花瓣分化期、雌雄蕊分化期以及花开放不同阶段圆珠期、铃梗期、初花期、盛花期和盛花末期的样品［18］，用于基因克隆、组织特异性和时空表达分析。所有材料使用液氮冷冻并于-80℃保存备用。

RNA提取试剂盒（RNAprep pure Plant Kit）购自天根公司（北京）。反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、胶回收试剂盒、PremixTaq酶、pMD-18T载体和大肠埃希菌Escherichia coliDH5α均购自Takara公司（大连），运用实时荧光定量PCR（Applied Biosystems，Foster City，美国）分析OfAP1基因的组织特异性及时空表达变化。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录 按照RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书提取各样品的总RNA，并参照Reverse Transcriptase M-MLV反转录酶说明书合成cDNA的第一链后，储存于-20℃备用。

1.2.2 桂花OfAP1基因的克隆 利用前期转录组测序获得的AP1 Unigene序列，设计特异性引物AP1-F： 5′-TAGAGTGAGAAAATGGGGAGA-3′；AP1-R： 5′-AATACAATCCCTGGCTACTT-3′。 以花芽分化期茎尖RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，PremixTaqDNA 10 μL和去离子水7 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；然后进行35个循环，每个循环包括95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃保温10 min，4℃保存。PCR反应产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测后回收、纯化，与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.3 序列生物信息学分析 对获得的基因序列进行生物信息学分析，其中编码区分析采用美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线网站 ORFFinder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）， 编码蛋白质的保守区段分析采用 NCBI Conserved Domain Search 软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），编码区蛋白质特征分析采用在线软件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。多序列比对采用软件DNAman，系统进化树构建采用Clustal X+MEGA 7.0软件并选择邻位连接法（neighbor joining method）用Bootstrap法检验1 000次。

1.2.4 实时荧光定量PCR 按照SYBRRPremix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒的说明书，检测桂花OfAP1基因不同组织以及不同时期的表达情况。OfAP1定量引物为qAP1-F：5′-GCAGAAGTGGCTTTGATTTG-3′；qAP1-R：5′-GTTTGCTGGTGACTGAGGTT-3′。同时以 OfACT 为内参qACT-F：5′-CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT-3′；qACT-R： 5′-ACCCCATCACCAGAATCAAGAA-3′［19］。 qRT-PCR 反应体系： 2×SYBR Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus） 10 μL， 上下游定量引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL， cDNA 2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL， 双蒸水补齐至 20 μL。 qRT-PCR 程序如下： 95 ℃预变性 30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。3次生物学重复。反应后根据熔解曲线分析qRT-PCR产物的特异性，并采用2-△△CT法计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 桂花OfAP1基因的克隆

以 ‘堰虹桂’花芽分化期cDNA为模板，扩增得到约750 bp片段（图1），其开放阅读框长为720 bp，编码239个氨基酸（图2）。该基因片段具有MADS-box基因的保守区，在NCBI上进行BLASTX在线分析，发现该序列与芝麻Sesamum indicum（AIS82596.1），葡萄Vitis vinifera（ACZ26528.1）和油橄榄Olea europaea（XP_022878350.1）等中AP1 基因的同源性最高，命名为OfAP1，并在GenBank注册，登录号为MH593222。

2.2 桂花OfAP1基因的氨基酸序列分析

OfAP1蛋白氨基酸序列运用NCBI在线CDD（Conserved Domain Datebase）分析发现，OfAP1具有典型的MEF2_like MADS结构域和K-box结构域，MADS结构域位于N端第2～74位氨基酸，K-box结构域位于第90～168位氨基酸（图2）。OfAP1蛋白的分子式为C1199H1941N341O368S16，其相对分子质量为27 534.62，理论等电点为8.4。负电荷残基总数（天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu）为32，正电荷残基总数（精氨酸Arg+赖氨酸Lys）为35。在组成OfAP1蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占比例最高，为11.7%，其次为谷氨酸（Glu），占10.0%，色氨酸（Trp）所占比例最低，为0.8%。预测亲水性指数（GRAVY）为-0.665，表明OfAP1具有较好的亲水性。

图1 桂花OfAP1电泳图Figure 1 PCR products of OfAP1

图2 桂花OfAP1氨基酸序列比对Figure 2 Comparative analysis of OfAP1 protein sequence

采用GOR4软件对OfAP1蛋白二级结构预测发现，OfAP1蛋白二级结构由α螺旋、伸展链和无规则卷曲组成，其中，α螺旋（Hh）占56.49%，β折叠（Ee）占10.46%，无规则卷曲（Cc）占33.05%。同时采用Phyre 2在线工具对OfAP1蛋白三级结构进行预测，OfAP1有3个典型的α螺旋和2个β折叠（图3）。NetPhos 2.0 Server预测结果表明：OfAP1蛋白序列中存在11个潜在的磷酸化位点，包括6个Ser位点（22Ser， 61Ser， 74Ser， 87Ser， 110Ser， 121Ser， 135Ser， 150Ser， 216Ser）和 1 个 Thr位点（220Thr）。NetNGlyc 1.0 Server预测结果表明：OfAP1蛋白存在1个潜在的N-糖基化位点，90Asn。

2.3 桂花OfAP1系统进化关系分析

为了分析OfAP1基因与其他物种中AP1基因的系统进化关系，采用MEGA 7.0软件构建系统进化树（图4）。单子叶植物（如短柄草Brachypodium distachyon，水稻Oryza sativa，玉米Zea mays）和双子叶植物可以明显地分为2个大类。桂花OfAP1与芝麻，豇豆Vigna unguiculata，枇杷，印加果Plukenetia volubilis，麻疯树，葡萄，芍药Paeonia lactiflora，柑橘Citrus sinensis以及拟南芥中的AP1基因聚在一起，说明这些基因亲缘关系较近且功能具有一定的相似性。

2.4 桂花OfAP1基因的组织特异性与时空表达分析

为明确OfAP1基因在桂花不同组织以及花芽分化不同时期的表达情况，对不同组织和器官（根、茎、叶、叶芽、花芽以及花）及不同发育时期的样品进行荧光定量RT-PCR分析。结果表明：OfAP1基因在花芽中的表达量最高，其次为叶，在茎中的表达比较弱，在根中几乎不表达（图5）。同时，与叶芽时期相比，OfAP1基因在分化初期（即花原基的形成以及花萼花瓣分化期）表达量最高，随后呈下降趋势（图6），到花开放阶段表达量均较低。

图3 桂花OfAP1蛋白的三级结构预测Figure 3 Tertiary structure prediction for OfAP1 protein

图4 桂花OfAP1的系统进化树Figure 4 Phylogenetic tree based on OfAP1 gene

图5 OfAP1基因在不同组织中的表达量Figure 5 Expression of OfAP1 gene in different tissues

图6 OfAP1基因在 ‘堰虹桂’成花及花开放过程的表达量Figure 6 Expression pattern of OfAP1 in flowers of different stages

3 讨论

AP1及其同源基因已在多个物种中克隆得到，但桂花中的AP1至今没有相关报道。本研究克隆得到OfAP1基因，发现其与芝麻、葡萄以及油橄榄等AP1基因高度相似，OfAP1氨基酸序列含有高度保守的MEF2_like MADS结构域和次级保守的K-box结构域以及可变C，MADS结构域具有结合DNA、蛋白质二聚化以及与其他因子结合的功能；K-box结构域的蛋白二级结构为3个α螺旋，具有介导蛋白-蛋白之间的相互作用［20］。AP1基因C末端的变化较大，但是不同类的MADS-box基因常含有一些保守的基序（motif），这些基序在蛋白复合体的形成和转录激活中起重要作用［21］。

开花是植物重要的发育阶段，是多条基因网络共同调控的复杂过程［2］。AP1基因是植物特有的MIKCC-Type MADS-box基因，既参与花分生组织的形成，又是花器官形成的重要基因，在植物成花中起关键调控作用［3］。根据在模式植物拟南芥中的研究，AP1是花分生组织形成的标志物，成花整合基因FT和SOC1能够激活其表达并使其参与对成花抑制基因TFL1基因的拮抗，促进花分生组织的形成。在花器官发育中，AP1一方面通过促进AP3和PI的表达诱导花瓣和雄蕊的发育，另一方面受到AG基因的抑制作用控制萼片和花瓣的发育［22］。在百合中AP1的同源基因LMADS5/6转基因拟南芥后发现其能够造成早花，并且花器官中萼片变成心皮状，花瓣变成雄蕊状结构［12］；同样地，在洋桔梗Eustoma grandiflorum中超表达AP1发现：转基因植株花期提前，部分花瓣出现雄蕊类似的结构，进一步突变体互补实验表明：AP1基因对花瓣形成，尤其是第2轮花被片的发育有重要作用［23］。在建兰Cymbidium ensifolium，芍药以及菊花Chrysanthemum morifolium等中，AP1基因在花芽中的表达量显著高于其他器官组织，尤其在花芽分化的初期阶段［24-26］。在桂花中，OfAP1在花芽中有较高的表达，其在花芽分化初期表达量显著上调，尤其是成花转变以及花瓣、花萼分化时期，而当完成花萼花瓣分化后，表达量则显著下调。这充分说明桂花OfAP1基因参与了桂花成花转变和花瓣、花萼等器官分化，但其具体作用机制还有待进一步通过转化实验加以验证。