苏丹Ⅳ与DNA在含金属离子环境中相互作用的研究

付彩霞，荣先国，高宗华

（滨州医学院化学教研室，山东烟台264003）

苏丹红属偶氮苯类染料，不溶于水，能溶于非极性有机溶剂和脂肪，主要用于化学工业如工业用油、蜡和肥皂业[1]。苏丹I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ能诱导肝细胞的癌变[2-4]，我国和许多国家都禁止将其用于食品生产中。DNA是遗传信息的载体与基因表达的物质基础，但能否行使正常的遗传功能尚依赖于它与其他分子的物理、化学相互作用。本文用荧光和紫外光谱法研究了苏丹Ⅳ与DNA在含金属离子环境中的相互作用，考查了各成分间的相互影响，为从分子水平上认识小分子与DNA的作用机理提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LS-55荧光分光光度计（美国Perkin Elmer公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pH-3C酸度计（上海逸龙科技有限公司）；电热恒温水浴锅（龙口市先科仪器公司）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子分析天平（上海精密仪器厂）。

鲱鱼精DNA（北京拜尔迪生物技术有限公司）；苏丹IV（国药集团上海化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（中国医药集团上海化学试剂有限公司）。

鲱鱼精DNA加Tris-HCl缓冲溶液配制储备液的浓度为1.6×10-3mol·L-1；苏丹IV用无水乙醇溶解，储备液浓度为 1.0×10-3mol·L-1；pH=7.4 Tris-HCl（含 0.1 mol·L-1NaCl） 浓度为 0.05 mol·L-1；配制浓度为 1.0×10-5mol·L-1的 FeCl3、CuSO4、MgCl2、CaCl2溶液。实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱测定方法

移取 1.0 mL 苏丹 IV 和 1.0 mL FeCl3、CuSO4、MgCl2、CaCl2于1 cm石英比色皿中，摇匀，荧光扫描，然后用微量进样器逐次加入不同浓度的鲱鱼精DNA，摇匀，室温下静止5 min后进行荧光扫描。狭缝为Ex=5 nm，Em=5 nm，激发波长为650 nm，荧光扫描范围630～670 nm。

1.2.2 紫外光谱测定方法

移取2 mL苏丹IV于1 cm石英比色皿中，以Tris-HCl缓冲溶液为参比溶液，测定其吸收光谱，用微量注射器先后加入鲱鱼精DNA和FeCl3、CuSO4、MgCl2、CaCl2溶液各50 μL，记录待测溶液在200～400 nm的紫外吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 金属离子和DNA对苏丹Ⅳ荧光光谱的影响

图l是在有无金属离子存在下苏丹Ⅳ对DNA的荧光光谱。从图1中无金属离子的光谱图可看出[5]，苏丹Ⅳ在650 nm处有一最大发射峰，分别加入不同浓度的DNA后，苏丹Ⅳ的荧光峰位置不变，但是荧光强度明显降低，说明苏丹Ⅳ与DNA发生了相互作用。随着金属离子的加入，该荧光峰的位置略有蓝移（649.50 nm），荧光强度也发生了不同程度的变化，表明四种金属离子均与苏丹Ⅳ形成了络合物。向四种络合物的体系（SudanⅣ-Ca2+；Sudan Ⅳ-Cu2+；Sudan Ⅳ-Mg2+；Sudan Ⅳ-Fe3+）中加入不同浓度的DNA溶液，荧光强度发生了不同程度的猝灭，且荧光强度都小于无金属离子的荧光强度，表明金属离子和DNA对苏丹Ⅳ荧光具有协同猝灭作用，可以推断在苏丹Ⅳ、金属离子和DNA之间形成了三元络 合物。

图1 苏丹IV与DNA在有无金属离子存在下的荧光光谱

2.2 金属离子和DNA对苏丹Ⅳ紫外吸收光谱的影响

图2 为在金属离子和DNA存在下苏丹Ⅳ的紫外吸收光谱。从图2可以看出，苏丹Ⅳ在213.50 nm处有一紫外吸收峰，随着金属离子的加入，该吸收峰的强度得到增强，表明四种金属离子均与苏丹Ⅳ形成了络合物。向四种络合物的体系中加入定量的DNA溶液，发现络合物体系的最大吸收峰吸光度得到了减弱，但减弱的程度很小，最大吸收波长没有发生变化，说明配合物与DNA发生了静电作用或沟槽作用[6]。

图2 金属离子和DNA存在下苏丹Ⅳ的紫外吸收光谱

2.3 金属离子存在下苏丹Ⅳ与DNA荧光猝灭机制

荧光猝灭根据作用机制不同可分为静态猝灭和动态猝灭两种，由荧光猝灭Stem-Volmer方程[7-8]：

公式（1）中F0和F为在猝灭剂不存在和存在时的苏丹IV荧光强度，CDNA为猝灭剂浓度，KSV为猝灭常数，τ0为不存在猝灭剂荧光分子的平均荧光寿命（τ0≈10-8s），Kq为双分子猝灭过程的速率常数。以F0/F对CDNA作图，由曲线斜率算得KSV。由KSV=Kqτ0求得Kq，见表1所示，可见在有无金属离子的条件下，Kq远大于小分子与生物大分子之间的最大扩散控制的碰撞常数2.0×1010L·mol-1·S-1，由此可知，该体系的猝灭机制是静态猝灭。

2.4 金属离子存在下苏丹Ⅳ与DNA相互作用的结合常数和结合位点数

根据静态猝灭公式：

公式（2）中KA为DNA与苏丹IV分子的结合常数，n为结合位点数。以lg[（F0-F）/F]对lgCDNA作图，通过斜率和截距求出DNA与苏丹IV的结合常数和结合位点数，见表2。

从表2可以看出，加入金属离子后，DNA对苏丹IV的结合常数KA和结合位点数n都发生了很大变化，说明金属离子对苏丹IV与DNA之间的作用产生了影响。DNA对苏丹IV的结合常数KA和结合位点数n从大到小依次为Fe3+>Ca2+>Cu2+>无金属离子>Mg2+，由此可得出Fe3+、Ca2+和Cu2+对DNA与苏丹IV之间的结合起促进作用，其中Fe3+、Ca2+的促进作用最大，而Mg2+则对DNA与苏丹IV之间的结合起抑制作用。

表1 有无金属离子存在下苏丹IV与DNA荧光猝灭常数和相关系数

表2 有无金属离子存在下DNA对苏丹IV相互作用的相关参数

3 结论

利用荧光光谱法和紫外光谱法研究了苏丹IV-DNA和苏丹IV-金属离子-DNA之间的相互作用机制。DNA能猝灭苏丹IV和苏丹IV-金属离子的荧光，其猝灭机制均为静态猝灭。金属离子介入实验表明，Fe3+、Ca2+和Cu2+对DNA与苏丹IV之间的结合起促进作用，而Mg2+则对DNA与苏丹IV之间的结合起抑制作用。