荧光熄灭法测定制剂中的叶酸含量

刘琳

（中安联合煤化有限责任公司，安徽淮南232001）

叶酸（FA）是人体健康生长活动必不可少的营养物质，对机体有着重要作用，适当补充叶酸能减少畸形儿的出生，预防儿童肾衰，减少癌症风险，预防老年痴呆，提高男性生育力，有益于记忆力和心血管健康[1]。近年来，国内外学者针对不同制剂、不同食品中叶酸含量开展研究，开发了多种叶酸含量测定的方法，如高效液相色谱法、紫外分光光度法、比色法、离子对色谱法等[2-11]。

上述测定方法有各自的优缺点，而荧光分析法操作简便，稳定性好，选择性高，特别适合微量或痕量物质的定性、定量测定和有机物质的分析。虽然荧光分析法测定叶酸的含量已有报道，但是基于叶酸对吖啶红-罗丹明B体系的荧光猝灭作用，建立的测定制剂中叶酸含量的方法还未见报道。因此本文研究了吖啶红-罗丹明B体系对叶酸的测定，建立了叶酸含量测定的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500荧光分光光度仪（日立，日本岛津株式会社）；AL204分析天平（梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）；雷磁pHS-25数显pH计（上海分析仪器厂）。试剂均为市售分析纯，标准溶液及缓冲溶液均按相关标准配制。

1.2 荧光光谱的绘制

在10 mL比色管中加入0.5 mL吖啶红溶液后，加入少量蒸馏水稀释，再定容至刻度，摇匀。放置5 min后，测定其荧光光谱，确定最大激发波长和最大发射波长。用相同的方法分别测定罗丹明B溶液、罗丹明B-吖啶红溶液体系以及吖啶红-罗丹明B溶液-叶酸的荧光光谱，确定其最大激发波长、最大发射波长。结果如图1～图4所示。

图1 吖啶红激发光谱

图2 罗丹明B激发光谱

图3 罗丹明B-吖啶红体系激发光谱

图4 发射光谱（a：吖啶红，b：罗丹明B，c:罗丹明B-吖啶红体系）

由图可知，吖啶红的最大激发波长为490 nm，荧光峰波长为528 nm；罗丹明B的最大激发波长为535 nm，吸收峰波长为578 nm，吖啶红的荧光峰波长距离与罗丹明B的吸收峰波长较为相近，这为以吖啶红作为能量给予体，罗丹明B为能量接受体建立的能量转移体系提供了前提条件。且由图3可知，吖啶红-罗丹明B混合体系的最大激发波长λmax为490 nm，因此实验选择用最大激发波长为490 nm去激发吖啶红与罗丹明B的混合体系，结果如图4，两种染料之间发生有效的能量转移，且能量转移效果较好。

在确定实验条件后，建立了AR-RB荧光共振能量转移法测定制剂中叶酸含量的方法。图5和图6分别为加叶酸后体系的激发光谱和发射光谱，表明加入叶酸后并未改变体系的最大激发波长和发射波长。如图6所示，用最大激发波长490 nm去激发AR-RB混合体系时，随着叶酸浓度增加，578 nm处混合体系的能量逐渐减弱，且荧光强度减弱的程度与叶酸的浓度具有一定的线性关系。

图5 加入叶酸后体系的激发光谱

图6 （1为吖啶红-罗丹明B体系，2-5分别为加入不同浓度叶酸后的曲线）

2 结果与讨论

2.1 能量给体和受体浓度的影响

实验发现，在5×10-6mol·L-1吖啶红溶液中分别加入不同浓度的罗丹明B后，用最大激发光谱λmax=490 nm去激发体系，在发射波长为528 nm处，吖啶红的荧光强度比单独存在时明显下降，而578 nm处罗丹明B的荧光强度显著增强。当吖啶红与罗丹明B的摩尔浓度比为1∶2时，体系的能量转移效率最大，且加入定量叶酸，体系荧光猝灭明显，灵敏度高，线性范围较宽，有利于含量测定。因此，综合考虑灵敏度和线性范围，实验选择0.5 mL浓度为1.0×10-5mol/L吖啶红溶液和1.0 mL浓度为1.0×10-5mol/L罗丹明B溶液，建立能量转移体系。

2.2 表面活性剂的影响（图7）

本实验研究了十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）对能量转移体系的影响。实验发现，SDS、TTAB对体系的荧光强度影响不大，但当加入一定量SDBS时，体系荧光强度明显增强，而且当加入一定量SDS后体系稳定性变差，故本实验选用SDBS作为体系的表面活性剂。

图7 表面活性剂的影响

分别加入 SDS、SDBS、TTAB 浓度为 0 mol／L、0.1 mol／L、0.3 mol／L、0.5×10-2mol／L后，能量转移体系荧光强度改变，如图7所示。当SDBS浓度为3×10-3mol/L时，体系的荧光强度达到最大值，且△F的值稳定，并大于其他表面活性剂下的△F。因此选择十二烷基苯磺酸钠的浓度为3×10-3mol/L。

2.3 溶液pH的影响

固定其他实验条件，用不同缓冲溶液来调节体系的pH值，实验结果如图8，最后优选在蒸馏水的中性条件下进行实验。

图8 pH的影响

2.4 反应温度的影响

图9 为实验条件下反应温度在10℃～40℃时对△F值的影响。根据实验结果可知，当反应温度过高或过低时，相对荧光强度△F会减小，在室温下，△F值达到最大，灵敏度较高，且体系的荧光强度相对稳定。因此，实验是在室温下进行的。

图9 反应温度的影响

2.5 反应时间的影响

按照实验方法分析了60 min内△F随反应时间的变化趋势，实验结果见图10。△F随着反应的进行随之增加，但反应5 min后，△F基本保持不变，且在5～60 min内保持稳定，可判断该反应基本完全。因此，实验反应时间为5 min。

图10 反应时间的影响

2.6 共存物质的影响

其他实验条件均不变，当FA浓度为1.0×10-5mol/L时，考查了多种常见金属离子、其他水溶性物质对实验的干扰情况，结果表明：当允许误差为±5%时，150倍的 Ca2+、K+、Zn2+对实验无干扰；300 倍的 Na+、Fe2+、Ba2+、SO42-、Cl-、葡萄糖、Vtamin C 对叶酸的测定无干扰，说明该方法具有较好的选择性。

2.7 标准曲线的绘制

按照实验方法，改变叶酸标准溶液的用量绘制标准曲线（见图11），其线性回归方程ΔF=965.6c+33.267（△F代表荧光强度猝灭值，c代表叶酸浓度，单位为10-5mol/L），线性相关系数R=0.998 9，叶酸浓度在5×10-6～2.5×10-5mol/L范围内与ΔF呈线性关系。对1.0×10-5mol/L，1.5×10-5mol/L，2.0×10-5mol/L 进行精密度实验，得到 RSD%分别为0.92%、0.64%、0.87%（n=5）；在1.0×10-5mol/L处平均回收率为97.79%。该方法的精密度和准确度较好。

图11 标准曲线的绘制

2.8 叶酸样品含量测定、精密度以及回收率测定

2.8.1 精密度实验

精密量取新配叶酸样品溶液1 mL，按照实验方法平行测定5次，实验结果见表1。

表1 精密度实验

2.8.2 样品回收率实验

精密量取叶酸样品溶液1.00 mL于10 mL比色管中，再向比色管中加入1.00 mL叶酸对照品溶液，定容至刻度，配制得样品溶液。测定叶酸含量，计算回收率，根据表2可得平均回收率为99.39%。

表2 回收率实验

2.8.3 样品溶液的测定

精密量取样品液1 mL于10 mL比色管中，按照实验方法平行实验6次，根据每次所得样品荧光强度，计算相对荧光强度，并代入线性回归方程中求得样品溶液中叶酸的含量，得到如下结果：叶酸的含量相当于标示量的99.47%，RSD约为0.74%。与采用高效液相色谱法（药典方法）测定出的含量（100.20%，RSD为0.66%，n=5）结果一致。

3 结论

AR-RB荧光共振能量转移法测定制剂中叶酸的含量效果较好。采用十二烷基苯磺酸钠溶液，在中性条件下，吖啶红与罗丹明B之间能发生有效的能量转移，随着叶酸的加入，体系荧光强度逐渐减弱，在此基础上可测定叶酸的含量。

按照本文方法测定制剂中叶酸的含量，可得叶酸的含量相当于标示量的99.47%，RSD约为0.74%，回收率为99.39%，与药典方法测得的含量（100.20%，RSD为0.66%，n=5）结果一致。

使用AR-RB荧光共振能量转移法测定制剂中叶酸含量，操作简单，稳定性好，灵敏度高，精密度、准确度良好，结果令人满意。