高效液相色谱法测定化妆品中羟苯丙酯含量的不确定度评价

吴查青

（丽水市食品药品与质量技术检验检测院药品中心 浙江丽水 323000）

1 前言

在化学分析中，经常遇到分析结果处于标准限度要求的边缘或者检测结果比较小的情况，这个时候，对于数据的可信程度，除了采取加标回收、随行质控样品之外，也常用测量不确定度来表征数据的离散程度。使用扩展不确定度，对可疑或已知存在的误差进行评定，代表测量结果的定量特征的可能性。它赋予了测量结果可能的结果范围，是评判边缘数据的合理参数。但是GB/T 27418—2017《测量不确定度的评定和表示》[1]中，只给出了采取直接测量方式的物理参数类结果的测量不确定度评定通用规定和实例，并未对化学分析类的测量不确定度给出较为明确的评定规则和步骤。新发布的CNASGL006-2019《化学分析中不确定度的评估指南》[2]对于如何评定化学分析不确定度进行了详细的阐述。本文按照该指南，对用高效液相色谱法测定化妆品中羟苯丙酯含量的不确定度进行了评价。

依据标准SN/T 4598—2016《化妆品安全技术规范》[3]，通过对高效液相法测定羟苯丙酯含量，并进行不确定度评价的研究，查阅文献资料[4-6]找到影响高效液相色谱法测定化学成分含量的过程中影响不确定度的因素，计算各个不确定影响因素对不确定度的相对贡献，并进行合成。本方法对高效液相色谱法测定羟苯丙酯的测量不确定度评定提供参考模型，普遍适用于对于高效液相方法测定的化学分析，具有较高的实用性，对于其他化学分析方法也具有借鉴参考价值。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（安捷伦1260，配二极管阵列检测器）；超纯水（密理博Advange-10），甲醇（默克，色谱纯）；羟苯丙酯（中国食品药品检定研究院）；索氏提取器；样品为柠檬润唇膏（上海天馨化妆品有限公司）。

2.2 分析步骤

称取样品2 g 于具塞比色管中，加甲醇至10 mL，振摇，超声提取 15 min，离心，经 0.45 μm 孔径的滤膜过滤，滤液作为待测溶液，供HPLC 检测，以标准曲线定量。

3 测量不确定度的评定

3.1 数学模型

羟苯丙酯含量的计算见下式:

其中，X—试样中羟苯丙酯的含量；Ax—试样中羟苯丙酯的峰面积；A0—羟苯丙酯标准品的峰面积；Mx—称取的试样重量；M0—称取的标准品重量；Vx—试样的稀释体积；V0—标准品溶液的稀释体积；p—标准品纯度。

3.2 测量不确定度的来源分析

（1）试样称量的不确定度；

（2）试样的稀释时引入的不确定度；

（3）标准品称量引入的不确定度；

（4）标准品稀释引入的不确定度；

（5）高效液相色谱仪引入的不确定度；

（6）标准品纯度引入的不确定度。

3.3 各分量不确定度的计算

3.3.1 标准品溶液配制引入的不确定度

精密称取10 mg 羟苯丙酯标准品至于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 至于20 mL 量瓶中。

（1）标准品纯度的不确定度:羟苯丙酯标准品由中国食品药品检定研究院提供，纯度100%，分散区间半峰宽α=0.05%，按均匀分布计算，纯度的标准不确定度u（p）=0.05%/30.5=0.029%，相对标准不确定度urel（p）=0.029%/100%=2.90×10-4。

（2）由标准品称量引入的不确定度:所用十万分之一电子天平精度为0.01 mg，最大允差为±0.1 mg，电子天平称量数据符合平均分布，包含因子不确定度u(Wr)=0.1 mg/30.5=5.774×10-2mg，标准品称样量为11.10 mg，采用减量法称重，天平的不确定度计算2 次，可得到相对标准不确定度urel(Wr) =(2×5.774×10-2）0.5/11.10=7.356×10-3。

（3）标准品溶液稀释引入的的不确定度:标准品溶液配制过程中的不确定度来源于容量瓶的体积不确定度和定容时的度数误差，还有移液时移液枪引入的不确定度。分析如下:

10 mL 和20 mL 单标线容量瓶体积的不确定度来自于校准时的准确度，实验所用容量瓶均为A级，10 mL A 级容量瓶的法定允差为±0.020 mL，考虑实际工作中极端值不易出现，中心区的分布几率大于极值，因此按照三角分布进行计算，取包含因子k=不确定度u(r10mL)1=0.02mL/60.5=8.166×10-3mL，相对标准不确定度urel(r10 mL)1=8.166×10-3/10=8.166×10-4。10 mL 容量瓶定容时的读数误差为±0.005 mL，按三角分布计算，不确定度u(r10 mL)2=0.005 mL/60.5=2.042×10-3mL，相对标准不确定度为urel(r10 mL)2=2.042×10-3/10=2.042×10-4。

20 mL A 级容量瓶的法定允差为±0.030 mL，按照三角分布进行计算，不确定度u(r20 mL)1=0.03 mL/60.5=1.225×10-2mL，相对标准不确定度urel(r20 mL)1=1.225×10-2/20=6.125×10-4。20 mL 容量瓶定容时的读数误差为±0.005mL，按三角分布计算，不确定度u(r20mL)2=0.005 mL/60.5=2.042×10-3mL，相对标准不确定度为 urel(r20 mL)2=2.042×10-3/20=1.021×10-4。

1000μL 的移液枪经过校准，扩展不确定度为7μL，k=2，则相对标准不确定度 urel（1 000 μL）=7/1 000=7×10-3。

合成以上不确定度来源，标准品溶液引入的相对不确定度 urel（Vr）=[urel(r10 mL)12+urel(r10 mL)22+urel(r20 mL)12+urel(r20 mL)22+urel（1 000 μL）2]0.5=[（8.1662×10-4+（2.042×10-4）2+（6.125×10-4）2+（1.021×10-4）2+（7×10-3)2]0.5=7.078×10-3。

3.3.2 样品溶液配制引入的不确定度

（1）由样品称量引入的不确定度:测量不确定度的分析同3.3.1，所用万分之一电子天平精度为0.1 mg，最大允差为±0.5 mg，按照平均分布，包含因子不确定度 u(Ws)=0.5 mg/30.5=2.887×10-1mg，样品称样量为 2 006.1 mg、2 011.5 mg，采用减量法称重，天平的不确定度计算2 次，则相对标准不确定度urel(Ws)=[2×（2.887×10-1）2]0.5/1 006.1=4.058×10-4。

（2）由样品稀释引入的不确定度:过程分析同3.3.1，体积校准引入的不确定度u（s10 mL）1=0.02 mL/60.5=8.166×10-3mL，相对标准不确定度 urel（s10 mL）1=8.166×10-3/10=8.166×10-4。读数引入的不确定度 u（s10mL）2=0.005mL/60.5=2.042×10-3mL，相对标准不确定度为urel(s10 mL)2=2.042×10-3/10=2.042×10-4。合成体积校准和读数引入的相对标准不确定度，urel（Vs）=[urel（s10mL）12+urel(s10 mL)22]0.5=[（8.166×10-4）2+（2.042 ×10-4）2]0.5=8.417×10-4。

3.3.3 由高效液相色谱仪引入的不确定度

取同一份样品溶液，连续进样10 次，所测10 次结果的平均值为3 625，标准偏差为28.85，根据Bessel 公式计算得到，不确定度u(A)=28.85，相对不确定度 urel(A) =28.85/3 625=7.959×10-3。

3.4 不确定度的合成

3.4.1 不确定分量汇总表

将上述分析的各个不确定度分量汇总，便于更加直观地比较在理化试验过程中哪个分量的不确定度更加重要，详见表1。

表1 各不确定度分量汇总

3.4.2 合成各分量不确定度

标准品溶液和样品溶液分别进样，故高效液相色谱仪引入的不确定度要计算2 次，羟苯丙酯含量的相对标准不确定度 urel（X）=[urel（p）2+urel（Wr）2+urel（Vr）2+urel(Ws)2+urel（Vs）2+2×urel（A）2]0.5=[（2.90×10-4）2+（7.356×10-3）2+（7.078×10-3）2+（4.058×10-4）2+（8.417×10-4）2+2×（7.959×10-3）2]0.5=1.523×10-2，经计算，试验所得羟苯丙酯的含量为769.5 μg/g，则含量的合成不确定度 U（X）=769.5 μg/g×（1.523×10-2）=11.7 μg/g。

3.5 扩展不确定度的评定

取包含因子k=2(近似95%置信概率)，则羟苯丙酯含量扩展不确定度 U=2U（X）=2×11.7 μg/g=23.4 μg/g。

3.6 结果表示

羟苯丙酯含量为 X=（769.5±23.4）μg/g（k=2）。

4 讨论

通过本方法的分析，可见各个不确定度分量中，不确定度的主要来源是标准品的称量、稀释以及仪器带来的测量误差，而样品称量及稀释的影响较小。分析原因，标准品的称样量太少，稀释步骤多，而样品的称样量大，稀释步骤少。可以得出结论:加大标准品的称样量，在前处理过程中尽量减少稀释步骤，并保养维护好仪器设备，使之更加稳定，可以降低不确定度。

本文根据CNAS-GL006—2019 《化学分析中不确定度的评估指南》，建立了羟苯丙酯含量的测量不确定度的评估方法，对于羟苯丙酯含量给出的扩展不确定度为3.0%，在理化检测领域，此结果属于合理范围，已经充分包含了仪器、人员、量具、操作等方面的所带来的不准确因子。