健骨注射液指纹图谱及有效成分的传递

梁玉婷，王静宇，苏薇薇，幸林广，姚宏亮，林桥辉，彭维

(1.中山大学广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275；2.广西南宁百会药业集团有限公司，广西 南宁 530003)

健骨注射液是由壮药特色药战骨制成的中药单方制剂，具有活血散瘀，强筋健骨，驱风止痛功效[1]，临床上用于治疗膝关节骨性关节炎，急性腰扭伤，神经根型颈椎病[2-4]。中药制剂化学成分复杂，单一成分定量测定难以全面控制成品质量。指纹图谱具有“整体性”和“模糊性”特点，能系统反映中药的整体特征，已被广泛用于中药质量评价[5-6]，中药注射剂标准提高和再评价工作也强调了指纹图谱的重要性[7]。本研究首次采用高效液相色谱法对健骨注射液进行指纹图谱研究，通过比较原料药材、中间体、成品指纹图谱差别，监控生产工艺的稳定性，并探讨成品有效成分与原料药材有效成分间的相关性，找出生产过程中的质量传递规律，全面监控产品的质量，具有实际应用价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪(美国Dionex公司，DGP-3600 SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000 SL自动进样器、TCC-3000 RS柱温箱、DAD-3000检测器、Chromeleon 7.2数据处理软件)；Triple TOF 5600液相-质谱联用仪(美国AB SCIEX 公司)；中药粉碎机(YB-400A型，永康市速锋工贸有限公司)；十万分之一电子分析天平(MS205DU，瑞士Mettlertoledo公司)；超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ250DE，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

乙腈(Honeywell，QAFA1H，色谱级)；冰乙酸(阿拉丁，E1519047，色谱级)，甲醇(天津市大茂化学试剂厂，20170503-2，分析纯)；甲酸为质谱纯；水为超纯水。夏佛塔苷(中国食品药品检定研究院，批号：1119-201302，纯度：w=92.5%)；维采宁-2(Sigma，批号：03980585，纯度：w=94.28%)；维采宁-3(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：4953，纯度：w=98.7%)；阴性对照由广西南宁百会药业集团有限公司提供。15 批次健骨注射液及对应原料药材、中间体的批号见表 1；另有一批次健骨注射液(批号：1608002，用于方法学验证)。

表1 15批次健骨注射液及对应原料药材、中间体Table 1 15 batches of Jiangu injection，raw herbs and intermediates

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 参照物溶液的制备 取夏佛塔苷、维采宁-2、维采宁-3对照品适量，精密称定，加φ=20%乙腈，超声处理(功率250 W，频率40 kHz，温度50 ℃)1 h使完全溶解，制成每1 mL含0.121 mg的夏佛塔苷、含0.166 mg的维采宁-2、含0.065 mg的维采宁-3混合溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取健骨注射液1 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 中间体溶液的制备 精密量取0.1 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 战骨药材溶液的制备 取战骨饮片粉末(过三号筛)约1.5 g，精密加入φ=80%甲醇25 mL，称量，静置30 min，再超声处理1 h，放冷，用φ=80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.5 阴性对照溶液的制备 取苯甲醇和聚山梨酯80各0.1 mL，置10 mL容量瓶中，加φ=20%乙腈定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

Welch C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈(A)-φ=0.3%冰乙酸溶液(B)，梯度洗脱(0～70 min:10%→20% A，90%→80% B)；柱温：30 ℃；流速1.0 mL/min，检测波长340 nm，进样量为10 μL。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》评价其相似度。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取健骨注射液、阴性对照、空白溶剂、中间体及战骨药材分别按“2.1”项下方法制备，在“2.2”项下色谱条件分别测定，结果各色谱峰均不受溶剂及辅料影响，表明专属性良好(图1)。

图1 健骨注射液指纹图谱专属性试验Fig.1 HPLC fingerprint of specificity test for Jiangu injection(A：混合对照品；B：空白溶剂-φ=20%乙腈；C：阴性对照；D：健骨注射液；E：中间体；F：战骨药材；1：维采宁-2；3(S)：夏佛塔苷；4：维采宁-3)(A：Chromatogram of mixture of references；B：blank solvent-20% acetonitrile；C：negative control；D：Jiangu injection；E：intermediate；F：Premna fulva Craib；1：vicenin-2;3(S)；schaftoside；4：vicenin-3)

2.3.2 精密度试验 取同一供试品溶液(批号1608002)，在“2.2”项下色谱条件连续进样6次，以3号峰为参照峰，计算其余6个共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果显示共有峰的相对保留时间RSD为0.03%～0.07%，相对峰面积 RSD为0.13%～0.95%，相似度均>0.99，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批样品(批号1608002)，平行6 份，按“2.1.2”项下方法制备，在“2.2”项下色谱条件分别进样，记录色谱图，结果显示各共有峰的相对保留时间 RSD为0.04%～0.07%，相对峰面积 RSD为0.17%～1.26%，相似度均>0.98，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号1608002)，在“2.1”项色谱条件下于0、3、6、9、12、24、48和72 h测定，记录色谱图，结果显示各共有峰的相对保留时间 RSD为0.03%～0.11%，相对峰面积 RSD为0.20%～1.94%，相似度均>0.96，表明供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.3.5 耐用性试验 取同健骨注射液供试品溶液(批号1608002)，分别使用WelchUltimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hitachi LaChrom C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三种型号的色谱柱，测定健骨注射液的指纹图谱，记录色谱图，结果显示各共有峰的相对保留时间 RSD为0.56%～2.42%，相对峰面积 RSD为0.12%～4.67%，相似度均>0.95，表明该方法耐用性良好。

2.4 指纹图谱的建立与相关技术参数

2.4.1 指纹图谱的建立 取10批健骨注射液、中间体、原料药材按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件分别进样，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》对10个批次指纹图谱进行评价， 7个色谱峰为各批次所共有，因此确定这7个峰为共有峰；10批所测健骨注射液、中间体、原料药材指纹图谱的相似度均在0.92以上，见表2。

表2 10批健骨注射液、中间体、原料药材指纹图谱与共有模式的相似度评价结果Table 2 Similarities of fingerprint for 10 batches of sample

2.4.2 成品与原料药的相关性考察 通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》对10批成品、中间体、原料药材指纹图谱共有模式进行评价，结果其相似度均>0.98，表明成品、中间体、原料药材相关性良好，健骨注射液生产工艺稳定，见图2。

图2 10批原料药材、中间体、成品指纹图谱共有模式图(峰1：维采宁-2;峰3(S)：夏佛塔苷;峰4：维采宁-3)Fig.2 common model of HPLC fingerprints for 10 batches of sample(1：vicenin-2;3(S)：schaftoside;4：vicenin-3)

2.4.3 成品指纹图谱检测 另取11～15批健骨注射液按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件分别进样，用上述10批健骨注射液所建立的共有模式为对照指纹图谱，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》对5批新生产的健骨注射液进行评价，结果相似度均>0.95。

2.5 共有特征峰的确证和指认

2.5.1 对照品对照法 分别精密吸取混合对照品及成品供试品溶液，注入液相色谱仪，按“2.2”项下色谱条件分析，采集色谱图，根据色谱峰的保留时间定位以及化学成分的 PDA光谱图信息对比，确定1号峰、3号峰、4号峰分别为维采宁-2、夏佛塔苷、维采宁-3，结果见图1。

2.5.2 UFLC-Triple-TOF-MS/MS成分鉴别 同参考文献[8]。检测结果通过质谱中分子离子峰和碎片离子峰的相对分子质量匹配、保留时间匹配等信息与参考文献[8]对比，鉴定了健骨注射液指纹图谱中其余4个色谱峰的化学成分，2号峰、5号峰、6号峰、7号峰分别为异夏佛塔苷[8]、Apigenin 6,8-di-C-arabinoside[8]、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-木糖苷[8]、芹菜素-6-C-β-D-木糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷[8]，质谱总离子流图见图3。

图3 健骨注射液正模式(A)和负模式(B)总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of Jiangu injection in both positive(A) and negative(B) ion mode

表3 10批原料药材、中间体、成品指纹图谱共有模式的相似度评价Table 3 Similarities of fingerprint for 10 batches of sample

表4 5批健骨注射液指纹图谱相似度评价Table 4 Similarities of fingerprint for 5 batches of Jiangu injection

2.6 原料药材与成品有效成分传递分析

2.6.1 对照品溶液的制备 同“2.1.1”项下参照物溶液的制备。

2.6.2 样品含量测定及转移率 取10个不同批次的健骨注射液、中间体、原料药材，按“2.1”项下制备方法进行处理后，按“2.2”项下色谱条件测定，分别计算维采宁-2、夏佛塔苷和维采宁-3的含量。再根据生产过程中药材投料量与成品得率，计算10批原料药材中这3种成分在健骨注射液中转移率。结果见表5。

表5 总含量在战骨药材、中间体、注射液的相关性研究Table 5 Correlation study of total content in Premna fulva Craib, intermediate and Jiangu injection

接上表

No.有效成分战骨药材w/(mg·g-1)中间体w/(mg·g-1)药材到中间体转移率/%成品w/(mg·g-1)药材到成品转移率/%08夏佛塔苷1.260.311-0.184-维采宁-21.450.420-0.477-维采宁-31.060.210-0.219-总计3.770.94124.960.88023.3409夏佛塔苷1.320.243-0.216-维采宁-21.240.331-0.296-维采宁-30.8510.170-0.138-总计3.410.74421.810.65019.0610夏佛塔苷0.7340.241-0.240-维采宁-20.6040.299-0.307-维采宁-30.3840.126-0.123-总计1.720.66638.680.67038.91药材平均总含量/(mg·g-1)5.54平均转移率/%29.09平均转移率/%26.43SD/%3.07SD/%5.21SD/%5.96药材平均总含量±SD/(mg·g-1)2.47～8.61平均转移率±SD/%23.88～34.30平均转移率±SD/%20.47～32.39

3 讨 论

本研究首次建立了健骨注射液指纹图谱，战骨药材、中间体、健骨注射液具有良好相关性，说明产品生产工艺稳定，所建立的指纹图谱可以全面监控原料药材、中间体和成品的质量。

本研究在构建指纹图谱的基础上，同时检测了健骨注射液中3种有效成分，考察它们在药材、中间体、成品中的含量变化情况，并探讨了生产过程中有效成分的质量传递规律。结果表明：从药材到中间体的提取，对健骨注射液有效成分的含量影响较大；在生产工艺稳定的情况下，投料药材的质量与成品的质量呈正相关，依据注射液中每克生药中有效成分的含量(mg)=药材中每克生药中有效成分的含量(mg)×转移率(%)，可通过药材成分含量推测成品有效成分含量。

中药的有效成分从原料药材到中间体的传递规律，反映了中药生产中的关键工艺环节，如提取溶剂的选择，提取时间及温度的设定等参数，对于生产优质中药产品具有积极意义。本研究揭示了有效成分从战骨药材到成品的传递规律，为健骨注射液的投料药材、生产过程及质量控制提供了指导，同时也为其他中药提供了参考。