黑曲霉在生物质废弃物资源化中的应用

姚兵莉，张继宁，蓝娜娜，张建国

(1.上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093； 2.上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海201403)

生物质是农业废弃物、林业废弃物、食品工业废弃物和生活废弃物中的主要成分，我国每年产出农业废弃物40多亿t[1]，大约产生3 700万m3的林业废弃物[2]。食品工业中的肉类加工厂废弃物每年产生约0.65亿t，饼粕类0.25亿t[3]。同时，每年产生的生活垃圾约为2.5亿t。由于废弃物数量大，如果废弃物露天堆放不仅占用了大量的土地，而且会造成环境污染问题，更存在安全隐患。生物质资源化是解决目前废弃物污染、能源和环境问题的一种有前途的方法。生物质既可以直接提供热量，也可以制备液体燃料或者化学品，是一种可再生资源。由于人类对能源需求的日益增加和化石能源贮量的缩减，生物质能源和生物基化学品的作用逐步凸显，所以生物质资源化非常有必要，也具有广阔的应用前景。

1 生物质的主要组分及其预处理方法

生物质的主要组分为由葡萄糖以β-1,4-糖苷键相互连接的纤维素；以木聚糖为主并包括木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯醛酸木聚糖、葡萄糖醛酸甘露聚糖组成的半纤维素；由酚类物质(羟基或甲氧基取代的苯丙烷单体)聚合在一起的木质素。

生物质资源化利用效果一般不理想，主要原因为生物质组分结构复杂，难降解。例如，纤维素中葡萄糖环之间的夹角和侧链与葡萄糖环之间的夹角变化较大，纤维素的聚合度低至几百，高达上万[4-5]；半纤维素中单糖和连接键类型也较多[6]；木质素中不规则分布的甲氧基、酚羟基、羰基、丙烯醛基和松柏醇基使木质素的分子结构更加复杂。不同种类生物质中组分含量也有较大差别。这对生物质的有效利用途径造成一定困难。

图1总结了常见的生物质材料中主要组分的含量。纤维素质量分数约30%～50%，木质素质量分数约20%～30%，果胶质量分数约5%～30%，上述3类天然高分子聚合物的质量分数在65%～90%波动。

图1 几种生物质组成Fig.1 Components of several biomass

利用生物质通常需要先预处理破坏其致密结构，然后再利用酶法进行降解。预处理的过程可以打断纤维素之间的链，去掉半纤维素的保护残基，改变木质素结构，达到打破生物质的致密结构、增加生物质组分与催化剂接触面积的目的[7]。生物质致密结构的破坏程度取决于预处理方法和生物质组分晶体结构和聚合度[8]。预处理方法有稀酸处理、碱处理、蒸汽爆破处理、有机溶剂处理和氧化处理等[9]。

酸处理在120 ℃下采用20～40 g/L稀硫酸处理1.5 h，降解半纤维素和部分半纤维素。酸处理方法的优点为简单、易操作，不足之处在于去除木质素效果不理想以及易产生抑制纤维素酶的糠醛、5-羟甲基糠醛等抑制剂[9]。

碱处理方法采用5～100 g/L NaOH、10～300 g/L CaCO3、50～300 g/L氨水、50～150 g/L CaO等溶液破坏木质素。碱处理的优点为过程简便、成本低，减少抑制剂生成。但是碱处理的不足在于碱具有较强的腐蚀作用[10]。

蒸汽爆破方法为160～260 ℃条件下将饱和蒸汽渗入生物质，然后突然释放蒸汽压力破坏生物质致密结构，加入少量硫酸、CO2、氨水与高压蒸汽形成协同作用，提高破坏效果[11]。

有机溶剂处理为采用乙二醇、丙三醇、苯、二氧乙烷、和三氯化铁或路易斯酸在160～200 ℃处理生物质1～2 h，可以降解掉80%左右的木质素和全部半纤维素[9]。

氧化处理利用O3、H2O2或O2在碱性条件下氧化分解纤维素和木质素。氧化处理也产生较多糠醛和5-羟甲基糠醛等抑制剂[9]。

将预处理后的生物质固体转化为单糖或者化学品是进一步利用生物质成分的重要途径。由于生物质组分和结构比较复杂，降解生物质组分需要多种酶协同作用[12]。很多学者研究水解生物质组分所需要的酶类。降解纤维素的酶有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。降解半纤维素的酶有内切β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、内切-β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖苷酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和p-香豆酯酶。降解木质素的酶有木质素过氧化酶、漆酶、锰过氧化酶、多样性过氧化酶[13]等。丝状真菌，尤其是黑曲霉，具有丰富的降解生物质酶系，广泛地被学者关注。而且，黑曲霉的遗传操作较为成熟，是优秀的细胞工厂，可以利用生物质积累高附加值的物质。为此，笔者总结黑曲霉在降解生物质方面的优势，为黑曲霉在生物质废弃物资源化中的应用提供参考。

2 黑曲霉具有丰富的降解生物质酶系

丝状真菌，例如黑曲霉、米曲霉、米根霉和里氏木霉[14]，是水解生物质酶的重要来源。表1总结了4种丝状真菌水解生物质酶的研究水平。由于生物质含有果胶[15]，所以表1也包含了水解果胶的酶。根据表1可以看出4种丝状真菌所产生的酶类有所不同。在19种酶中，黑曲霉、米曲霉、米根霉和里氏木霉分别存在3、6、13、5种酶缺失。黑曲霉能产生的酶类最多，而且有11种来自黑曲霉的比酶活比来自里氏木霉的比酶活高。这说明黑曲霉更加适合作为产生水解生物质酶的工业微生物。黑曲霉是一个表达工业用酶的模式微生物[16]，已经有多种酶在黑曲霉中成功表达，例如木质素过氧化酶[17]、阿魏酸酯酶[18]和锰过氧化酶[19]等。

表1 降解生物质组分涉及的常见酶类

注：ND表示没有具体活力数值；a表示此处酶活单位为U/mg;b表示此处酶活单位为U/mL。

预处理后得到的生物质需要多种酶协同降解，但所需酶的组成也根据生物质组分和预处理方法的不同而不同。例如，玉米芯经过碱处理后需要50 U/g 葡聚糖的内切纤维素酶、30 U/g 葡聚糖的外切纤维素酶和30 U/g 葡聚糖的β-葡萄糖苷酶进行水解[67]；大豆皮需要用50 U/g 纤维素的纤维素酶、15 U/g 纤维素的β-葡萄糖苷酶进行水解[68]。水解过程中外切纤维素酶应该有足够的活力以避免纤维二糖抑制内切纤维素酶。利用生物质培养微生物产酶，进而水解生物质的效果比外加酶的效果好，这是由于省去了纯化酶的步骤[7]。

近年来通过对多株黑曲霉基因组进行研究，结果也表明黑曲霉自身并不能产生水解生物质组分需要的所有酶[69]。有学者利用多种微生物的协同作用来生产所需要的酶，从而达到单一微生物无法达到的作用，不仅提高了酶产量，也为微生物水解生物质提供了思路[70]。混合多种微生物水解生物质的不足在于控制多种酶的比例技术复杂，而且高菌体量降低了生物质的利用率。黑曲霉被改造后可以高效表达多种外源酶[71]。利用黑曲霉同时表达多种酶水解生物质是目前的热门研究方向。为了避免一种微生物同时高效表达多种酶的困境，Brunecky等[72]开发出了一种具有多种纤维素酶活力的纤维素酶CelA。

3 黑曲霉作为优秀的细胞工厂

随着生物技术的发展，围绕黑曲霉的信息、研究技术和方法也较为完善。例如，已经有多株代表性的黑曲霉菌株完成基因组测序[73]，进一步建立了蛋白质分泌途径，有利于黑曲霉表达外源基因[74]。通过优化同源重组步骤中同源序列长度、载体构型、打靶位点敲除了黑曲霉中的NHEJ(非同源结合)修复途径的蛋白Ku70和蛋白Ku80，实现了可以定向同源重组的遗传操作系统[75]。此外，通过强启动子的开发、蛋白酶缺陷菌株的构建、系统生物研究技术等方式将黑曲霉改造成优秀的细胞工厂[71,76-77]。除了黑曲霉自身分泌很多种酶[78](表1)，黑曲霉作为细胞工厂已经表达多种外源酶：木聚糖酶、葡萄糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、果胶甲酯酶、磷酸脂肪酶、植酸酶[79]、果胶酶、葡萄糖氧化酶[80]、木质素过氧化酶、葡萄糖糖化酶和呋喃果糖苷酶[81]。黑曲霉表达真菌来源酶的表达量比其他来源的蛋白表达量高，这可能是由于真菌来源的蛋白在蛋白水解、糖基化等方面较为适合黑曲霉[82]。

目前，基于基因组数据也建立了黑曲霉代谢网络调控技术，有利于柠檬酸等代谢物的积累[83]。早在20世纪30～40年代黑曲霉就是生产柠檬酸的工业菌株。目前全世界99%的柠檬酸(150万t/a)是由黑曲霉菌生产[71]。黑曲霉积累柠檬酸伴随着多个酶的上调表达，其中13种酶对高产柠檬酸是必要的[84]。黑曲霉还可以生产葡萄糖酸(4.5 g/(L·h))[85]、半乳糖醛酸[86]和琥珀酸[87]。

黑曲霉还可以利用羟基化、氧化、还原、去甲基化、硫化、脱氯、开环和接合等反应生物转化生产高附加值化合物[88]。例如，黑曲霉将丁酰乙酸乙酯还原为光学纯度99%以上的3-(R)-羟基己酸乙酯[89]，转化杂环化合物、环氧化合物和芳香族碳水化合物[88]、萜类化合物、类固醇和类黄酮等物质成为药物和化工中间体[90-91]。

随着新一代基因编辑技术CRISPR/Cas(规律成簇间隔短回文重复/核酸酶)的出现，黑曲霉基因改造的效率得到快速的提高[92-93]。Sarkari等[94]报道瞬时表达Cas9可以100%整合基因的技术，还展示了基于CRISPR/Cas技术提高乌头酸产量的效果。Zheng等[95]建立了基于CRISPR/Cas的黑曲霉U6启动子表达系统。这些技术必将加速黑曲霉作为细胞工厂方面的应用。

4 黑曲霉利用生物质废弃物产高附加值产品

黑曲霉利用生物质废弃物可以产酶或者高附加值产品[96]。黑曲霉来源的酶制剂具有产量大、应用范围广、安全性高的特点，已愈来愈受到人们的重视[71]。黑曲霉已成为工业应用常见的菌种之一。已经商品化的来自黑曲霉的酶有α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、糖化酶、过氧化氢酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、葡萄糖苷酶、橙皮苷酶、葡萄糖酶、单宁酶、柚苷酶、蛋白酶和果胶酶等。美国食品药品监督管理局(FDA)允许食品工业使用的酶以来自黑曲霉的酶数量最多。

4.1 纤维素酶

黑曲霉广泛应用于纤维素酶的生产[97]。黑曲霉的纤维素酶活力比来自里氏木霉的酶活高[98]。以生物质为基质培养黑曲霉生产纤维素酶，既可以有效利用生物质，又可以生产酶等高附加值产品。目前已有多种生物质被用来培养黑曲霉生产纤维素酶。例如，Chandra等[99]以落花生秸秆和麦麸为基质培养黑曲霉产生的纤维素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力均显著高于其他菌类的活力。黄凡等[100]以三七渣培养黑曲霉生产纤维素酶的比酶活达73.23 U/g(以1 g湿三七基质计)。Mandal等[101]以香蕉皮为基质培养黑曲霉产生纤维素酶的羧甲基纤维素酶的比酶活(CMCase)和滤纸纤维素酶活力(FPase)分别达到111.05 U/g和9.45 U/g(以1 g干基质计)。高大响等[102]以豆渣为基质培养黑曲霉产生的纤维素酶的比酶活达475 U/g。乔君毅等[103]利用玉米秸秆培养黑曲霉3.314 8菌株，经发酵后玉米秸秆的成分发生了变化：粗蛋白含量提高了1.2倍，粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维质量分数分别下降了34%、19%、23%；黑曲霉产生的CMCase和FPase的比酶活别达29.94 U/g和13.56 U/g。Sharma等[104]利用豌豆荚废料固态发酵培养黑曲霉HN-1得到滤纸纤维素酶(FB)的比酶活可达30 FPU/g。

还有很多学者尝试从自然界分离高产纤维素酶的黑曲霉菌株。Bansal等[105]从农田土壤中分离的黑曲霉 NS-2以玉米芯、胡萝卜皮、堆肥、杂草叶、橘子皮、菠萝皮、番茄皮、稻壳、甘蔗渣、木屑、麸皮和麦秸秆培养都可以产生纤维素酶，其中，以小麦麸皮为基质培养黑曲霉NS-2产生的纤维素酶活力最高(CMCase 310 U/g、FPase 17 U/g)。Cunba等[106]从黑胡椒中分离出黑曲霉菌株A12，分别用甘蔗渣和甘蔗渣水解液培养后纤维素酶的生产强度达57 U/(L·h)。李兰晓等[107]利用啤酒糟培养1株黑曲霉后产生的纤维素酶CMCase和FPase的比酶活分别达到14 187.8 U/g和759.9 U/g(以1 g干基质计)。因此，筛选高产纤维素的黑曲霉菌株是非常重要的方向，也具有广阔的应用前景。

4.2 半纤维素酶

木聚糖酶是半纤维素酶类的重要组成部分，可以分解饲料原料细胞壁中半纤维素的木聚糖，降低物料的黏度，促进有效物质的释放，以利于营养物质的吸收。同时木聚糖水解得到的低聚木糖作为功能性低聚糖，可促进机体对酸性饮料和发酵食品中钙的吸收[108]。所以木聚糖酶不仅在生物质利用中有重要作用。魏桃英等[109]优化了含玉米芯和豆饼粉的培养基培养黑曲霉后产生26 371 U/g的木聚糖酶。王维超等[110]采用苹果渣为基质培养黑曲霉产生木聚糖酶的酶活达到5 736 U/g、β-甘露聚糖酶的酶活达到896.24 U/g(以1 g干基质计)。Desai等[111]在16株黑曲霉菌株中筛选到的黑曲霉DX-23可产48.9 U/mL木聚糖酶，该木聚糖酶可以有效脱除旧报纸浆的油墨，使旧报纸浆的亮度提高78.8%，对这株黑曲霉继续紫外诱变后木聚糖酶的酶活可提高到 150.9 U/mL[112]。

高木糖含量的玉米棒和麦麸等废弃物是诱导黑曲霉产生木聚糖酶的良好物质。Dobrev等[113]以玉米芯为基质培养黑曲霉B03，使其木聚糖酶活力提高了33%。Ottenheim等[114]以棕榈果壳为基质培养黑曲霉DSM 26641产生24.5 mU/mL木聚糖酶，转录组学分析显示这株菌产生3种木聚糖内切酶、2种β-木糖苷酶、4种阿拉伯呋喃糖酶、1 种乙酰木聚糖酯酶、2 种阿魏酸酯酶。黑曲霉SCTCC 400264产生耐热的木聚糖酶的比酶活可达2 547.7 U/mg，该木聚糖酶在80 ℃条件下保持30 min仍有74%活力[115]。从印度Baramura森林中分离得到的黑曲霉KP874102.1产生的木聚糖酶的比酶活达到426 178 U/mg[116]。

4.3 木质素降解酶

黑曲霉ATCC 1015基因组中有多个可能的漆酶序列，McoB基因已经被证实可以表达较高量的漆酶[117]。Ishfaq等[55]利用RAPD技术分析了10株黑曲霉，鉴定出1株高产漆酶的黑曲霉菌株。利用玉米秸秆固态发酵培养黑曲霉CGMCC 5992，产生木质素过氧化酶的酶活达到652.34 U/L[53]。虽然黑曲霉本身不产生锰过氧化酶和多样性过氧化酶，但是Cortes-Espinosa等[19]利用黑曲霉作为宿主高效表达了黄孢原毛平革菌的锰过氧化酶，并且成功用于降解土壤中的菲。虽然还没有在黑曲霉中表达多样性过氧化酶的研究，但是已经实现了黄曲霉表达杏鲍菇多样性过氧化酶的研究[118]，所以利用黑曲霉表达多样性过氧化酶也很有希望。

4.4 果胶酶

果胶酶已经用于果汁澄清、果蔬汁提取、果实脱皮、木材防腐、麻类脱胶和棉织物精炼加工等行业[119]。黑曲霉可以产生3种果胶酶：果胶裂合酶[58]、聚半乳糖醛酸酶[62]和转化酶[65]。黑曲霉利用生物质废弃物产生果胶酶的研究有很多。例如，曹珂珂等[120]以葡萄渣为基质利用黑曲霉BB-6产生12.23 U/g干基质的果胶酶。近年来研究人员通过原生质体突变[121]、紫外线诱变[122]以及紫外与LiCl复合诱变[123]等方式提高黑曲霉产生的果胶酶产量。

4.5 高附加值产品

黑曲霉可以提升食品废弃物的品质，提高其附加值。例如，利用黑曲霉在豆渣上生长提高其可溶性膳食纤维的品质[124]，改善豆渣的口感[125]，改善米糠粕可溶性纤维的品质[126]。黑曲霉还可以利用香蕉皮制备可溶性膳食纤维[127]，从韭籽粕、豆粕和核桃粕中提取多肽[128]，从豆粕中制备大豆异黄酮[129]。黑曲霉还用于从玉米废弃物制备蛋白质[130]，和酵母一起转化秸秆为生物乙醇[131]。

5 展望

随着可持续发展的概念深入人心，生物质废弃物资源化利用是可持续发展的必要组成部分。黑曲霉在生物质资源化利用中的主要优势为黑曲霉作为食品安全级的微生物已经应用于很多方面。黑曲霉具有较丰富的自身水解酶系，黑曲霉的遗传操作技术较成熟，为黑曲霉同时产生水解生物质组分的全酶系提供技术支撑，黑曲霉可以积累多种高附加值物质，这些优势有助于黑曲霉在生物质资源化过程中发挥作用。

但是，黑曲霉在生物质资源化利用过程中仍有大量的工作需要开展。首先，解析黑曲霉调控表达水解酶的机制。黑曲霉利用不同生物质组分时表达不同水解酶。这说明黑曲霉可以感应底物组分，并进行相应的反馈。探究黑曲霉控制水解酶表达的转录机制，解析表达机制有利于调控黑曲霉表达水解酶系。其次，构建高效表达全酶系的工业菌株。近年来基因编辑技术的出现为黑曲霉表达多种外源酶提供了技术支撑，但是目前还没有关于表达水解生物质全酶系的黑曲霉菌株的报道。最后，优化生物过程高效利用生物质。黑曲霉利用水解酶将生物质资源化的过程受到生物过程中多个条件的影响，例如传质、传热等，所以生物过程的控制也是重要研究内容。随着研究的深入，黑曲霉将在生物质资源化方面发挥更大的作用，不仅推进生物质资源化利用的进程，还为黑曲霉的应用提供了舞台。