PCBP1对神经毒素6-OHDA诱导的小胶质细胞凋亡的影响

贾冰冰 叶 梦 霍丽蓉

帕金森病是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要是以纹状体多巴胺减少和中脑黑质多巴胺神经元凋亡[1]。免疫炎性、线粒体功能障碍、蛋白质聚集和氧化应激是其主要发病机制,目前对症治疗可减缓PD的进展[2]。6-OHDA可引起氧化应激进而导致神经元损伤[3]。有研究显示，单侧脑内注射6-OHDA可导致黑质致密体区中87%多巴胺能神经元的破坏和同侧纹状体中85%多巴胺含量减少[4]。因此，目前6-OHDA被广泛用于建立PD模型。小胶质细胞主要分布于中脑黑质。激活的小胶质细胞可参与神经变性疾病的发生和发展，贯穿中枢神经系统整个病理变化过程。在PD动物模型中，黑质致密体可通过小胶质细胞产生抗炎反应[5～7]。

PCBP1属于核不均一核糖核蛋白家族，是一种RNA结合蛋白，含有多聚胞嘧啶[poly(C)]特殊结合位点[8]。核不均一核糖核蛋白家族在人和小鼠组织中广泛表达，且都含有3个KH同源域。PCBP1可通过KH同源域识别与结合poly(C)DNA,进而发挥重要生物学功能[9]。PCBP1可参与转录调控，编码蛋白可参与主要的细胞功能如细胞增长和细胞周期的调控。为深入研究在神经毒素作用下，过表达的PCBP1是否对BV-2细胞周期有一定影响，本研究通过构建PCBP1重组质粒表达载体，把PCBP1全长cDNA瞬时转染入BV-2细胞系，并且检测细胞周期变化，为进一步研究其功能提供可能。

材料与方法

1.材料与试剂：小鼠小胶质细胞系BV-2(首都医科大学基础医学院神经生理室惠赠)；DMEM/F-12培养基，胎牛血清、1%青/链霉素、小提质粒试剂盒、感受态细胞Dh5α、限制性内切酶EcoR Ⅰ、LipHigh脂质体高效转染试剂(上海生物工程有限公司)；反转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR Master Mix(北京索莱宝生物科技有限公司)；AnnexinV/PI双染凋亡试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；6-OHDA(美国Sigma公司)；pEGFP/N1-PCBP1重组质粒(本室构建保存)。

2.pEGFP/N1-PCBP1的鉴定：以含PCBP1重组质粒为模板，常规PCR对PCBP1的全长cDNA进行扩增，含Ecol Ⅰ酶切位点，PCR产物经酶切、纯化后与真核表达载体pEGFP-N1连接，转化感受态细菌Dh5α后,筛选出具有卡那霉素抗性阳性单克隆菌株，在液体培养基中摇菌进行扩增，小提质粒后，进行DNA测序和电泳检测。扩增PCBP1的引物，上游引物为5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′；下游引物为5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAGCTGCACC-3′。

3.基因转染和6-OHDA作用两组细胞:将对数生长期BV-2细胞按照1×105个/毫升接种于12孔板中，每孔1ml完全培养基进行培养，待细胞的汇片率达到70%～80%时，将原细胞培养基移去，更换为无血清培养基，对细胞进行饥饿处理8h时，将1.6μl pEGFP/N1-PCBP1和pEGFP/N1质粒以及4μl高效转染试剂分别加入100μl无血清DMEM/F12培养基中，室温孵育5min后，将转染试剂加入质粒中，室温静置20min，再将混合物逐滴加入细胞中，边滴加边摇晃培养皿。细胞培养箱中孵育8h后，更换为DMEM/F12完全培养基。同时设转染pEGFP/N1-PCBP1质粒设为实验组、转染 pEGFP-N1质粒为对照组。转染 24h时，于荧光显微镜下观察细胞发绿色荧光，明确PCBP1基因转染成功后，将6-OHDA按照不同剂量(5、15、25μmol/L)作用24h和相同剂量作用不同时间(8、16、24h)的实验方法滴加到实验组和对照组细胞中，于细胞培养箱中继续培养，分别设3个复孔。

4.Annexin V/PE和7AAD双染法检测细胞周期：收集实验组和对照组经6-OHDA介导后的BV-2细胞，置于离心管中，5min,1000r/min常温下进行离心。再用4℃预冷的PBS对细胞进行洗涤，重复洗涤后，用1×结合缓冲液重悬细胞，取约100μl细胞悬液加入流式管中，加入5μl Annexin V/PE混匀，室温避光孵育5min；再加入7AAD 10μl,立即进行流式检测。

结 果

1.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1鉴定:重组质粒pEGFP/N1-PCBP1，转化感受态细胞，于含卡那霉素的LB液体培养基置于摇床上进行摇菌，提取质粒，进行测序鉴定，结果显示cDNA序列及插入位点均正确，详见图1。

图1 DNA测序分析重组质粒pEGFP/N1-PCBP1箭头所指为PCBP1基因插入质粒的相应位点

2.质粒转染BV-2细胞:用重组pEGFP/N1-PCBP1和对照质粒 pEGFP/N1分别对BV-2细胞进行转染，转染48h后，在倒置荧光显微镜下观察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1可发可发出绿色荧光，详见图2。

图2 pEGFP/N1及pEGFP/N1-PCBP1在BV-2细胞中的表达(×40)A.对空载质粒pEGFP/N1在 BV-2细胞中的表达；B.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1在 BV-2细胞中的表达

3.过表达PCBP1基因对BV-2细胞周期的影响:不同浓度(5～25μmol/L)6-OHDA对BV-2作用24h后，实验组和对照组细胞早期凋亡率逐渐增加，实验组为4.63%±1.48%、7.61%±0.39%、12.12%±0.62%；对照组为8.95%±0.47%、14.23%±0.23%、19.40%±2.42%，且实验组和对照组比较，早期凋亡率明显减低，差异有统计学意义(P<0.05)，晚期凋亡率无明显变化，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1、图3。 6-OHDA 25μmol/L作用8、16、24h后，实验组和对照组细胞随着时间延长，早期凋亡率逐渐增加，实验组为6.99%±0.61%、9.40%±0.50%、12.12%±0.62%；对照组为13.03%±0.37%、15.01%±0.79%、19.40%±2.42%，但同一时间，早期凋亡率实验组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组细胞晚期凋亡率随作用时间无明显变化，两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2、图4。

表1 不同浓度6-OHDA分别对实验组和对照组作用24h后细胞凋亡率变化

对照组为转染空载质粒pEGFP/N1的BV-2细胞；实验组为转染重组质粒pEGFP/N1-PCBP1的BV-2细胞。与对照组同浓度比较，*P<0.05

图3 不同浓度6-OHDA分别对实验组和对照组作用24h后细胞凋亡率的流式检测结果A.对照组细胞5μmol/L 6-OHDA;B.对照组细胞15μmol/L 6-OHDA;C.对照组细胞25μmol/L 6-OHDA；D.实验组细胞5μmol/L 6-OHDA;E.实验组细胞15μmol/L 6-OHDA;F.实验组细胞25μmol/L 6-OHDA；其中右上象限为晚期凋亡细胞,右下象限为早期凋亡细胞

表2 25μmol/L 6-OHDA对实验组和对照组作用不同时间后细胞凋亡率变化

与对照组同时间比较，*P<0.05

图4 25μmol/L 6-OHDA分别对实验组和对照组作用不同时间后细胞凋亡率的流式检测结果A.对照组细胞6-OHDA作用8h;B.对照组细胞6-OHDA作用16h;C.对照组细胞6-OHDA作用24h；D.实验组细胞6-OHDA作用8h;E.实验组细胞6-OHDA作用16h;F.实验组细胞6-OHDA作用24h；其中右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞

讨 论

目前，细胞凋亡被认为是神经系统疾病发生的机制之一，然而除了细胞坏死,神经细胞可出现其他细胞死亡过程[10]。在帕金森病中，纹状体区的多巴胺神经元出现凋亡和坏死[11]。有研究显示交感神经元暴露于多巴胺导致细胞收缩和核碎裂。这些结果表明帕金森病中的黑质细胞变性可能是由于不适当的多巴胺诱导的死亡，死亡的多巴胺神经元显示出一些细胞凋亡形态特征[12]。

PCBP1通常被称为RNA结合蛋白，存在3个hnRNP K同源性(KH)结构域，约70个氨基酸与RNA结合[13]。PCBP1通过与多聚胞嘧啶结合可发挥多种功能，其功能繁多复杂，包括mRNA稳定、转录后修饰、翻译激活和剪切[14，15]。PCBP1是一种多功能蛋白分子，研究表明，PCBP1与铁离子转运、病毒复制、肿瘤等疾病有密切联系，而PCBP1与神经系统疾病发生与发展的研究也日益增加[16～18]。神经丝(NF)是最丰富的细胞骨架共同体，它们组成了一个有髓鞘的无脊椎动物轴突神经元中间丝蛋白家族。通过亲和纯化的质谱法，发现来自大鼠脑的蛋白质鉴定出3种K-同源性(KH)结构域RNP-hnRNP K，hnRNP E1，hnRNP E2-能够结合NF-M RNA。hnRNPs K、E1和E2是涉及NF基因表达的重要信息转录调控子。研究发现NF mRNAs确实与这些RNP内源性结合，且其结合程度在出生后随着神经发育过程而发生改变，这些关联程度的改变依赖于RNP或NF-L、M、H mRNA信息的丰富程度，同样表明RNA-蛋白质之间的相互作用可被直接调控[19]。本课题组前期研究显示，PCBP1可促进神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y生长，同样证明PCBP1对神经细胞的生长状态具有一定的调节作用[20]。据报道，在病毒感染、细胞凋亡和热休克过程中，细胞内的核糖体进入位点(internal ribosome-entry site，IRES)可持续表达。Ken Nishimura等研究显示，在IRES的翻译中，PCBP1可与ORF57相互结合，进而增强凋亡抑制子的活性。该研究证实PCBP1主要通过IRES来调节细胞和病毒基因的表达，进而发挥抗凋亡作用。

对于PCBP1基因与神经细胞周期变化是否存在一定的关联鲜有深入探讨。本研究通过将将重组质粒pEGFP/N1-PCBP1转染入BV-2细胞，使其在BV-2细胞中过表达。将不同剂量6-OHDA对转染PCBP1的BV-2细胞作用24h后，结果显示，实验组和对照组细胞比较，早期细胞凋亡率明显减低(表1、图3)。再将25μmol/L的6-OHDA分别对转染PCBP1的实验组和对照组细胞作用不同时间后，进行流式细胞仪检测。结果显示实验组较对照组BV-2细胞的早期凋亡率同样明显减低(表2、图4)。而在上述实验中，实验组和对照组细胞的晚期凋亡率比较差异无统计学意义。实验结果提示，在神经毒素作用条件下，PCBP1对神经细胞周期的干预作用主要体现在早期凋亡阶段。当神经细胞进入晚期凋亡时期，PCBP1并不能起到有效阻断作用。将进一步探讨该蛋白阻断神经细胞发生早期凋亡事件的生物学机制。希望能够为存在神经细胞凋亡、坏死相关的神经系统退行性疾病如PD，提供更加有效的治疗手段。